广西岩溶区烟草黑胫病拮抗细菌的筛选鉴定及其抗病机理

从广西岩溶区靖西县优质烟叶生产区分离烟草黑胫病病原及土壤细菌,通过拮抗试验、离体及田间抗病能力测试等方法筛选拮抗细菌;利用形态观察、生理生化测试和16SrDNA序列分析三种方法相结合,对抗病效果良好的菌株进行分类鉴定;并对拮抗菌抗黑胫病机理进行初步研究。结果表明:从8份土壤样品中,共分离出土壤细菌340株,获得抗黑胫病效果良好的拮抗细菌3株,编号为8-23、6-70和13,它们分别属芽孢杆菌属、溶菌杆属和假单胞杆菌属细菌;三个拮抗细菌的抗黑胫病机理是通过胞外分泌一些可溶解病原菌细胞壁的酶或其它化学物质,破坏菌丝的细胞壁和细胞膜等生理结构,使细胞质渗漏、凝集,从而导致病原死亡;其中,菌株8-23和13的抗病活性物质主要为蛋白质类化合物;而菌株6-70除蛋白质外,还有其它一些非蛋白因子起作用。

烟草黑胫病菌拮抗内生细菌的筛选和鉴定

为寻找防治烟草黑胫病新途径,2001至2003年,从湖南永州和宁乡等地烟草黑胫病发病严重的田块采集健株,共分离到内生细菌株120株,经测定,8株内生细菌菌株在室内有较强的拮抗作用,这8株内生细菌与烟草黑胫病菌共培结果显示,55y,NN-3,YN-4和YN-10对烟草黑胫病菌抑菌效果均在66%以上.根据内生细菌形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生细菌55y为假单胞杆菌属铜绿假单胞菌,NN-3为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌,YN-4,YN-10为芽孢杆菌属凝结芽孢杆菌,且这4菌株均为烟草内生细菌.

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotianabenthamiana),并对转基因烟草T0和T1代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytoph-thoraparasiticavar.nicotianae)、赤星病菌(Alternariaalternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。

烟草黑胫病菌研究进展(一)

系统综述了烟草黑胫病菌的发现与命名、分类、生物学特征、分布与为害、致病机理、生理特性及寄主范围等方面的最新研究进展。

防治烟草黑胫病有益内生细菌的筛选及其抑菌作用

为筛选具有防病作用的植物内生细菌,采用常规分离方法从不同生长期的健康烟株的根、茎、叶中分离得到内生细菌127株,平板对峙培养法从中筛选出12株对烟草黑胫病菌具有明显拮抗作用的菌株,它们的抑菌带宽度达到5mm以上。对其进行了皿内拮抗试验、发酵液抑菌试验和温室防病试验。有8个菌株培养液滤液中存在具有抑菌作用的活性成分。其中wy2、wy11、wy4培养滤液的抗菌活性最强(>30%),它们的细菌培养滤液能破坏病原菌菌丝形态,使烟草黑胫病菌菌丝细胞膨大、细胞壁破损、原生质外渗、菌体崩溃、生长缓慢。温室盆栽试验表明wy11对烟草黑胫病的防效最好,为51.7%。此外,内生细菌wy11和cj17发酵液灌根对烟株具有一定促生作用,能提高烟株茎围、叶长、叶宽。以细菌16S rDNA同源性为基础的系统发育分析表明防病促生内生细菌wy11与B.amyloliquefaciens(AB255669)处于同一分支,相似性为99%,初步将菌株wy11鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens。

绿针假单胞菌PL9菌株对烟草疫霉的拮抗作用研究

利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法研究了棉花根圈细菌绿针假单胞菌 (Pseudomonascholoraphis)PL9菌株对烟草黑胫病病原菌烟草疫霉 (Phytophthoraparasiticavar .nicotianae)的拮抗作用 ,该菌株对烟草疫霉菌丝体有很强的抑制作用 ,并且可以完全抑制烟草疫霉游动孢子对烟草幼苗的侵染 ,其液体培养物浓缩过滤液也有相同的抑制作用 ,拮抗作用机理研究结果表明 ,其拮抗作用可能与PL9菌株分泌的抗生素类物质有关。为了解PL9菌株在烟草根圈的定殖情况 ,采用全套发光酶基因 (luxCDABE)标记的菌株PL9L进行跟踪 ,结果表明该菌株可以在烟草根圈成功定殖。

广西烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性检测

【目的】研究广西烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性,为烟草黑胫病药剂防治提供科学依据。【方法】采用菌落生长速率法对从广西主要烟区采集分离到的196株烟草黑胫病菌株进行对甲霜灵的敏感性测定。【结果】甲霜灵对196株菌株的EC50在0.0691-1.0243μg/mL,平均EC50为0.3618±0.0297μg/mL;来自田林县的菌株TL05为最敏感菌株,EC50为0.0691μg/mL;来自靖西县画洞镇的菌株ZXHD12为最耐药菌株,EC50为1.0243μg/mL;各烟区烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性有一定差异,其中南丹、田林县的菌株较敏感,而隆林、靖西、德保、富川县的部分菌株较耐药;196株菌株中,敏感型、一般耐药型和耐药型菌株分别占1.53%、66.84%和31.63%。【结论】广西烟草黑胫病菌已对甲霜灵产生不同程度的抗性,甲霜灵作为生产上防治烟草黑胫病的主要药剂具有较大的风险,建议生产上甲霜灵与其他杀菌剂进行轮换使用。

黑胫病菌诱导的烟草SSH文库构建及其分析

黑胫病是危害严重的世界性烟草主要病害之一,探究烟草对黑胫病的抗病机制,可以为该病的综合防治提供理论依据。本研究以烟草黑胫病抗性品种革新3号为材料,利用黑胫病0号生理小种诱导其水平抗性,分别在接种后0.5、1、3、6、10和16d取样,通过抑制差减杂交技术(SSH)构建cDNA文库,获得了960个阳性克隆。利用反向Northern斑点杂交技术对其中240个阳性克隆进行杂交筛选,筛选出57个表达差异明显的基因,序列拼接后获得33条高质量EST,测序及其比对分析表明,革新3号对烟草黑胫病抗性相关基因主要涉及抗病防卫、光合作用、信号传导和能量代谢等方面。进一步基因功能分析显示,病程相关PR1b蛋白、半胱氨酸蛋白、延伸因子1-α、α-微管蛋白、细胞色素P450、精胺合成酶、水通道蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、甘氨酸延伸因子等可能参与了烟草与黑胫病菌非亲和互作过程。

柠檬草精油对烟草黑胫病的抑制活性研究

研究了5种常见植物精油的抗烟草黑胫病活性,确定了植物精油的种类与浓度,为烟草黑胫病防治的精油药剂的开发与应用提供理论依据。采用菌丝生长抑制法和茎秆接种法,分别评价了植物精油对烟草黑胫病的体外和体内抑菌活性。结果表明,在体外条件下,柠檬草精油对烟草黑胫病的抑制效果最好,具有浓度梯度抑制效应,最低抑菌浓度为320μg/mL;在体内条件下,柠檬草精油640μg/mL时对烟草黑胫病预防与治疗效果最佳,病情指数分别为16.67和56.79,相对诱导效果分别为81.93%和38.44%,与甲霜灵190μg/mL无显著性差异。柠檬草精油具有优越的体外和体内抗菌活性,是有潜力的生物抗菌剂和杀菌剂,有望在今后的烟草黑胫病菌防治中进一步开发利用。

烤烟品种K326内生细菌分离、抗黑胫病菌株筛选及种群组成分析

从烤烟品种K326的不同生长时期分离内生细菌1000株,以烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)为靶标,共筛选出168株拮抗菌,这些内生细菌对黑胫病菌的抑菌率在12.54%～50.14%之间。苗期和团棵期的内生菌含量较高,但在开花和成熟期时降低了一个数量级,而拮抗菌数量呈上升趋势。对168株拮抗菌的16SrRNA基因序列进行RFLP分析,共产生10种带型。根据RFLP带型选取39株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育分析。结果表明,这168株生防内生细菌归于2大类群:Firmicutes和Actinobacteria。Firmicutes类群中的芽孢杆菌属(Bacillus)是优势属,共6种RFLP带型,150个菌株,包括Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum,Bacillus tequilensis,Bacillus methylotrophicus,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis和Bacillus aryabhattai。Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum和Bacillus methylotrophicus的出现频率最高,共126株,占该属总菌株数的78.75%。其余18个菌株分属于4个种:即Brevibacillus formosus,Brevibacillus parabrevis,Pseudomonas umsongensis和Pseudomonas aeruginosa。

烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性风险

为了评估烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性风险,以对甲霜灵敏感和高抗的烟草黑胫病菌240和191为出发菌株,进行了抗性突变频率测定、抗性诱变、抗性水平测定、遗传稳定性、生长速率、致病性测定和适合度等研究。结果表明,烟草黑胫病菌对甲霜灵敏感的240菌株在含10mg/L甲霜灵的CA平板上的抗性突变频率为7.0×10-5。分别以药剂诱变和紫外诱变获得了抗甲霜灵菌株240-YY和240-ZY。对甲霜灵敏感性不同的烟草黑胫病菌适合度测定结果表明,抗性菌株在潜伏期、侵染率、病情指数和病斑面积等方面均具有较高的适合度水平。研究结果显示,烟草黑胫病菌对甲霜灵具有较大的抗药性风险。

重庆市烟草黑胫病菌生理小种研究初报

在重庆市涪陵、彭水、石柱等烟区采集了40个烟草黑胫病菌菌株,并采用游动孢子悬浮液注射接种鉴别寄主和TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)颜色反应两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明,40个菌株对烟草品种L8具有较强的致病力,而对Nicotiana nesophila无致病力;在TTC培养基中皆呈现红色反应,说明供试的40个菌株皆为1号生理小种。

烟草黑胫病抗性鉴定方法比较及其相关性分析

为明确烟草黑胫病(Phytophthora parasitica var.nicotianae Tucker)抗性鉴定方法,采用粗毒素浸种法、粗毒素浸根法、孢子悬浮液浸根法及田间病圃接种法,研究烟草革新3号(抗病品种,R)、G28(R)、金星6007(中抗品种,MR)、小黄金1025(感病品种,S)、红花大金元(S)等对烟草黑胫病的抗性,并对其抗性鉴定效果进行相关性分析。结果表明,孢子悬浮液浸根法的鉴定结果与粗毒素浸种法的鉴定结果呈显著负相关,与田间病圃接种法的鉴定结果呈显著正相关。粗毒素浸种法不受季节限制,可以对烟草材料黑胫病的抗性进行大批量筛选。粗毒素浸根法和田间病圃接种法有一定的缺陷,可以作为粗毒素浸种法和孢子悬浮液浸根法的辅助鉴定方法。在整个抗性鉴定过程中,孢子悬浮液浸根法可观测到烟株病情指数和发病率的动态变化,较其他3种方法更能准确、合理地评价品种抗性。

壳聚糖对烟草黑胫病菌抑制作用

以烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotianae,Ppn)为材料,探讨了4种不同分子量的壳聚糖、壳聚糖的浓度和pH对烟草黑胫病菌的影响。结果表明,壳聚糖处理后烟草黑胫病菌菌丝出现畸变,正常的新陈代谢和细胞壁结构受到明显影响和破坏。在低浓度下(0.625mg·L-1),壳聚糖抑菌效果随分子量增大而增强;分子量越小受浓度影响越大,浓度≥5mg·L-1时,分子量为4.7×104的壳聚糖抑菌效果最强。除分子量5.0×103的壳聚糖外,其它分子量较大的壳聚糖受pH影响明显。壳聚糖分子量不同,其抑菌主要机理可能也不同,浓度、pH和分子量对其抑菌活性具有较强的影响。

烟草黑胫病菌株亲缘关系的RAPD分析

从２２０个ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡｓ）随机引物中所选出的多态扩增性强的２１个引物对来源不同的刀个烟草黑胫病菌株进行全基因组ＤＮＡ遗传多样性分析和指纹构建。选用引物对受试菌株进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增，共产生２４３条ＤＮＡ标记图带，其中１９１条为多态性图带，多态检测率为７８．６％。利用ＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｔｈｔｅＰａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ＭｅｔｈｏｄＷｉｔｈＡｒｉｔｈｍｅｔｉｃ Ａｖｅｒａｇｅ）软件对受试菌株间的遗传距离进行聚类分析构建系统树状图，受试对个菌株被划分为５个遗传聚类组即（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。结果证明供试菌株具有丰富的遗传多样性，虽各自的遗传背景差异显著，但其亲缘关系相近，遗传聚类组的划分与菌株的地理来源未有明显的相关性。

芸薹属植物提取液与异硫氰酸酯类制剂对烟草疫霉菌的抑制作用

为寻找有效防治烟草黑胫病的生物材料,采用生长速率法和抑菌圈法测定了3种芸薹属植物提取液和3种异硫氰酸酯类制剂对烟草疫霉菌菌丝的抑制作用。结果表明:(1)与对照相比,不同浓度的芸薹属芜菁、芥菜和油菜提取液均显著抑制烟草疫霉菌菌丝的生长,EC_(50)值分别为11.39、9.18和5.88 mg/mL,油菜提取液对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效应最佳。(2)与对照相比,不同浓度的异硫氰酸烯丙酯(AITC)和甲基异硫氰酸酯(MITC)制剂也均显著抑制烟草疫霉菌菌丝的生长,EC_(50)值分别为2.07和4.44 mg/L,AITC对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效应最佳;而异硫氰酸苯酯(PITC)对烟草疫霉菌菌丝生长无明显的抑制作用。可见,3种芸薹属植物和2种异硫氰酸酯类制剂(AITC和MITC)对烟草疫霉菌具有较好的生防效应。

烟草黑胫病菌的田间群体分布规律

从云南省不同烟区采集不同生态条件的土壤标样 ,用土壤稀释平板法和叶片诱饵法分离烟草疫霉并进行群体数量及分布规律的研究。结果 ,不同生态的土壤中烟草疫霉群体数量及分布存在着显著的差异 :连作田、低湿地、感病品种栽种地等土壤中烟草疫霉的群体数量大于轮作田、高燥地、抗病品种地等土壤中的群体数量 ;偏酸性土壤中的烟草疫霉群体数量较中性土壤和碱性土壤中的病菌群体数量大 ;根际土的烟草疫霉群体数量随距离根部的增加而减少。黑颈病田间发病率与土壤中烟草疫霉的群体数量呈正相关性。弄清土壤中烟草疫霉的群体数量及其田间群体分布规律 ,有助于烟草种植规划的制定。

硅酸盐细菌B925对烟草黑胫病菌的抑制作用及其16S rDNA序列分析

用从烟草根际土壤中分离的一株硅酸盐细菌B925及其发酵原液和发酵液的无菌滤液进行了对峙培养促进烟草种子萌发、离体叶片接种法和室内盆栽防治烟草黑胫病试验16S rDAN序列分析。结果表明:①B925发酵液处理能促进烟草种子萌发;②能减轻烟草黑胫病的扩展。对烟草黑胫病的预防作用为58.3%;③该菌为胶质芽孢杆菌。

烟草品种防御酶活性对黑胫病菌响应差异

以不同抗、感黑胫病烤烟品种云85(高抗)、K326(中抗)、净叶黄(中感)和红花大金元(高感)为供试材料,采用人工接种方法研究了黑胫病菌诱导的这些品种超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性差异及其与品种抗性的关系。结果表明,接种黑胫病后不同抗性品种SOD,POD,PPO和PAL活性与对照相比均出现明显提高,抗病品种SOD和POD活性较感病品种上升快且维持较高活性水平,且抗病品种POD酶活高峰较感病品种出现得早;抗病品种PPO和PAL较感病品种活性上升幅度更大,维持时间更长。相关性分析表明,SOD,POD,PPO和PAL活性与品种的黑胫病抗性呈正相关关系。

木霉菌对烟草疫霉的拮抗作用

通过对峙培养试验测定木霉菌(Trichodermaspp.)对烟草疫霉菌(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)的抑制作用,筛选出对烟草疫霉菌具有拮抗作用的绿色木霉(T.viride)菌株TG050609.平板对峙培养试验结果表明:该木霉菌对烟草疫霉菌菌落生长的抑制率为29.12%,且能寄生于烟草疫霉;其挥发性次生代谢产物和发酵滤液对烟草疫霉也有明显的抑制作用.盆栽防治试验结果表明,该木霉菌对烟草黑胫病的防治效果达到56.53%,优于58%甲霜灵锰锌WP.