高密度发酵P.pastoris诱导表达egⅡ基因

用套叠PCR法扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡聚糖内切酶Ⅱ(egⅡ)基因。扩增基因经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,获得重组表达质粒pPIC9K-egⅡ。通过电转法将egⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的转化子作为工程菌。工程菌的发酵在生物反应器中进行,在50 L的发酵罐中加入20 L发酵液。连续24 h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后以甲醇为碳源诱导egⅡ基因表达48 h。放罐时生物量为A_(600)=203,重组EGⅡ产量为90 mg/L。表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。

β-葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用 PCR的方法 ,以 Bacillus macerans总 DNA为模板 ,构建出β 1 ,3 1 ,4葡聚糖酶杂合基因bgl HAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体 p PIC9K重组 ,得到重组质粒 p PIC9K HAM,电脉冲转化法转化酵母菌 GS1 1 5 ,KM71 .在 MM,MD平板上筛选表型 ,YPD G41 8平板上筛选多拷贝重组子 .重组菌株经甲醇诱导后 ,刚果红平板染色法检测到β葡聚糖酶活性 ,SDS PAGE证明表达产物的分子量约为 2 4k D,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株 ,胞外每 m L发酵液最高酶活达 2 40 U.

高密度发酵P.pastoris诱导表达葡聚糖外切酶

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBHⅡ酶。方法:PCR法扩增木霉的cbhⅡ基因。将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌。重组CBHⅡ酶的生产是在50 L生物反应器中进行。连续24h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后用甲醇诱导表达64h。结果:放罐时生物量为A600=180,重组CBHⅡ产量为80mg/L。表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。结论:实现应用pAOX1表达系统在生物反应器中高密度发酵P.pastoris诱导表达CBHⅡ。该研究为重组CBHⅡ的规模化生产打下基础。

巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高密度发酵研究进展

高密度发酵已经成为提高毕赤酵母目的蛋白表达量的关键技术之一,而其中发酵工艺又是高密度发酵的一个重要因素。主要从巴斯德毕赤酵母遗传学特性、表达宿主菌、表达载体、外源蛋白的表达方面进行了阐述,并从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计、发酵过程关键参数调控以及甲醇诱导等方面阐述毕赤酵母的高密度发酵。最后,提出了巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中存在的问题并进行展望。

黑曲霉GA Ⅰ基因的克隆及在P.pastoris中的分泌表达

采用RT-PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPICZαA载体中,转入巴斯德毕赤酵母GS115中,获得8株重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达174U/mL,占上清液蛋白的36%。

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达cbhⅡ基因

用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的重组蛋白CBHⅡ达到50 mg/L。用CMC酶活法测定发酵液中的CMC酶活力为2.05 U/mL。

工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-lac2)的构建及诱导表达漆酶的研究

用PCR法扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因lac2。构建表达质粒pPIC9K-lac2。通过电转法将lac2基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性和高表达漆酶的转化子作为工程菌GS115(pPIC9K-lac2)。在发酵罐中发酵GS115(pPIC9K-lac2)表达重组蛋白。在50 L发酵罐中加入20 L无机盐发酵培养基。在发酵的第一阶段连续24 h补加50%甘油-0.8%PTM4增殖P.pastoris,然后用甲醇-0.8%PTM4诱导49 h。在发酵过程中,通过调节搅拌的频率和通气量,将溶氧维持于20%～30%,用氨水维持pH 5.0.放罐时生物量为A_(600)=266.5,表达漆酶1097.5U/L发酵液。

希夏邦马峰地区始新世地壳加厚和隆升过程

中新世中期之前喜马拉雅山脉的隆升历史和深部动力机制,还存在极大的争议、缺乏基本的数据约束。喜马拉雅造山带核部高级变质岩的埋藏和折返过程可以约束地壳加厚和山脉隆升过程,但是现有的变质记录主要为渐新世晚期-中新世中期,始新世变质作用的分布范围、形成过程和地质意义仍然未被充分挖掘。本文首先厘定了希夏邦马峰(8027m)山体的基本岩石组成:下部为高喜马拉雅正/副片麻岩,上部为肉切村群变粒岩及贯入其中的淡色花岗岩席。进一步对1964年希夏邦马峰登山科考采集的眼球状片麻岩进行了变质作用相平衡模拟和独居石微区原位U-Th-Pb定年,确定了始新世变质记录的P-T-t演化轨迹:M1阶段中P/T型变质压力峰期,条件为~1.0GPa、~740℃(~22℃/km),变质年龄为~37Ma;后近等温降压至M2阶段低P/T型变质温度峰期,条件为0.5~0.4GPa、~760℃(45~57℃/km),变质年龄为~25Ma;在~18Ma左右冷却至固相线以下。希夏邦马峰~37Ma的中P/T型变质和地壳加厚事件与北喜马拉雅穹隆、高喜马拉雅主体、前陆飞来峰等地区的记录一致(40~37Ma,20~25℃/km),表明印度-亚洲初始碰撞约20Myr后中上地壳被堆叠埋藏至>33km以下,发生了广泛的整体性加厚和深熔作用。该事件与喜马拉雅内陆残留海最终退却的时间吻合,是喜马拉雅山脉初始隆升的诱因。喜马拉雅山脉不是晚新生代以来隆升的,而是经历了自始新世中期以来的长期地壳堆叠和隆升过程。

电力P2P交易中计及社会福利的产消者合作联盟

随着分布式清洁能源发电技术的发展,传统电力用户逐渐转变为电能产消者,并可采用合作联盟形式参与电力P2P(peer to peer)交易,促进分布式清洁能源就地消纳。该文通过从源端和传输端分别核算碳减排量的方法,构建一类考虑经济效益和环境效益的社会福利函数,研究分布式电能产消者通过合作联盟形式实现社会福利最大化的途径。设计一种依据产消者对联盟社会福利贡献值分配合作剩余的机制,激励产消者合作的积极性以维持联盟的稳定。算例分析表明:相较于P2G(peer-to-grid)交易和非合作P2P交易,产消者以合作联盟方式参与电力P2P交易的社会福利分别提升了62.62%、33.79%。因此,以市场化的方式组建合作联盟参与电力P2P交易并合理分配利益,可挖掘分布式清洁能源就地消纳的潜力,促进能源消费的绿色低碳转型。

基于分形维数的高速铁路地震预警系统地震P波震相识别方法

为更好保障高速铁路的运营安全,高速铁路地震预警系统的实施十分必要。5级以下的小震事件占据地震事件的95%以上,提高高速铁路预警系统在小震震相识别的速度与精度能有效保障高铁安全运营。提出一种基于分形维数的地震震相识别算法,优化传统分形维数的计算方法,提高分形维数的计算速度。引入分形斜率曲线并划分为4个阶段,分析临界点的分形斜率特征,通过识别分形斜率极值时刻判断地震波精准到达时刻。提出的算法平均误差达到0.006 3 s,标准差达到0.043 8 s,满足高速铁路地震预警系统的时效性和准确度要求。

活性金属Ni d电荷密度对Ni_(2)P/Al_(2)O_(3)催化剂菲加氢性能的影响

高温煤焦油中菲含量高,将菲深度加氢饱和得到全氢菲,可提升菲利用率,且全氢菲密度大,热值高,可作为喷气燃料理想组分。然而,在菲加氢反应过程中菲与中间加氢产物的竞争吸附不利于菲在催化剂上吸附活化,且对称八氢菲进一步加氢是菲加氢饱和过程的速控步骤,其吸附活化困难不易解决,催化剂活性难以满足加氢需求。根据稠环芳烃与过渡金属间π络合吸附机理,在反应物吸附活化过程中,稠环芳烃分子和活性金属分别充当电子供体和电子受体,故Ni基催化剂中活性金属Ni处于缺电子状态时利于生成全氢菲,但关于Ni缺电子量及其电子结构如何影响催化剂菲、对称八氢菲加氢性能的原因需进一步探究。此外,基于负载型Ni_(2)P催化剂稳定性高、耐硫、耐氮性强等优势,采用次磷酸盐歧化法通过调变P/Ni物质的量比制备具有不同Ni d电荷密度的Ni2P/Al_(2)O_(3)催化剂,考察Ni d电荷密度对菲、对称八氢菲吸附和反应性能的影响规律。结果表明,在320℃、5 MPa、空速1 309 h-1反应条件下,Ni-2.5P/Al_(2)O_(3)催化剂转换频率fTO最高(44.64×10^(-3)s^(-1))。通过吸附活化熵描述菲、对称八氢菲与催化剂表面间相互作用强度,发现菲、对称八氢菲在不同Ni-xP/Al_(2)O_(3)催化剂表面吸附强度不同。通过定量计算Ni d电荷密度,明确了Ni2P/Al_(2)O_(3)催化剂用于菲加氢反应时适宜Ni d电荷密度约-0.24 e,对称八氢菲加氢反应适宜的Ni d电荷密度约-0.05 e。

基于电磁时间反演P范数判据的配电网故障定位

目前电磁时间反演(electromagnetic time reversal,EMTR)多应用在单一线路故障定位,且现有判据在高阻抗接地情况下效果不理想。针对上述问题,基于EMTR故障定位原理和均匀传输线理论推导了传播过程中线路故障信号与测量信号的传递函数,根据传递函数的相关性提出了P范数判据。利用ATP-EMTP搭建10 kV配电网线路,对比了2范数与P范数判据在复杂配电网中的定位性能,并验证了所提判据在混合配电网线路的适用性。最后,分析了配电网发生低阻抗及高阻抗接地故障下P范数判据的鲁棒性。仿真结果表明,该方法在过渡电阻高达3 kΩ的情况下能准确定位,且定位精度高,受噪声、故障类型和采样频率的影响小。

新风胶囊抑制软骨细胞炎症和细胞外基质降解:基于调控miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴

目的探讨新风胶囊(XFC)对白介素(IL)-1β诱导的软骨细胞功能的影响及作用机制。方法构建IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型;SD大鼠灌胃制备XFC含药血清。细胞增殖实验(CCK-8)和流式细胞术筛选最佳XFC含药血清浓度;双荧光素酶报告分析miR-502-5p和TRAF2的靶向关系。构建miR-502-5p抑制表达质粒(inhibitor)及阴性对照组,转染至软骨细胞中。分为对照组(NC),IL-1β组,XFC组,IL-1β+NC-inhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor+XFC最佳含药血清组,酶联免疫吸附试验(ELASA)检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10的水平。逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹实验(WB)、免疫荧光法检测Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、软骨蛋白聚糖抗体(ADAMTS5)和miR-502-5p/TRAF2/NF-κB基因的表达。结果与NC组相比,IL-1β组中软骨细胞活力下降,细胞凋亡率升高,且miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降,IL-1β、TNF-α和ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高(P<0.05)。筛选得出20%XFC为最佳含药血清浓度。与IL-1β组相比,XFC含药血清干预后,软骨细胞活力升高,细胞凋亡率下降,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κBp65表达下降,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达升高(P<0.05)。与NC-inhibitor相比,转染miR-502-5p inhibitor后,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降;与miR-502-5pinhibitor相比,将miR-502-5pinhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后,XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态对软骨细胞炎症和ECM的影响。结论XFC抑制软骨细胞炎症、细胞外基质降解,减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤,其机制可能是通过调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴。

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

芪红散对巨噬细胞分化及炎症水平的影响

目的 研究芪红散对巨噬细胞分化及炎症水平的影响及其机制。方法 将单核细胞在PKC激活剂(PMA)的诱导下转化为巨噬细胞。仅使用PMA诱导的细胞定义为M0组,使用脂多糖(LPS)和γ干扰素(IFN-γ)诱导处理的细胞定义为M1组,在使用LPS和IFN-γ诱导处理的基础上加入低剂量以及高剂量芪红散进行干预的两组分别定义为M1+芪红散-L组以及M1+芪红散-H组。分别采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹试验(WB)检测4组细胞的增殖、凋亡、迁移情况和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、p50、p-p65水平。结果 与M0对比,M1组增殖、迁移、CD86^(+)分化比例、TNF-α、IL-6、p50及p-p65水平显著增加(P均<0.05),CD206^(+)分化比例、IL-10水平显著降低(P均<0.05)。与M1组比较,M1+芪红散-L组与M1+芪红散-H组CD86^(+)分化比例、TNF-α、IL-6表达水平均降低(P<0.05),且M1+芪红散-H组TNF-α及IL-6表达水平明显低于M1+芪红散-L组(P<0.05),IL-10表达水平明显高于M1+芪红散-L组(P<0.05)。与M1组比较,M1+芪红散-H组p50及p-p65表达水平均降低(P<0.05),M1+芪红散-L组206^(+)分化显著升高(P<0.05)。结论 芪红散可有效地减少巨噬细胞的CD86^(+)型分化,抑制炎症信号通路核因子-κB(Nuclearfactor kappaB,NF-κB)的激活从而降低炎症因子的表达,减轻炎症反应。

聚酪氨酸/纳米金电化学传感器检测水环境中环丙沙星

利用聚酪氨酸有机薄膜负载金纳米粒子作为检测环丙沙星的基底材料,制备了p-Tyr/AuNP s/Au电化学传感器,对环丙沙星(CFX)表现出良好的电催化性能。用扫描电镜对材料的形貌进行了表征,CFX在该材料表面的反应为二电子转移的受吸附控制的过程。用单因素实验对L-酪氨酸(L-Tyr)单体的浓度、聚合的扫描圈数、金纳米沉积时间、溶液pH值进行了优化。在最优条件下,在6.60×10^(-7)~1.57×10^(-5)mol·L^(-1),ΔI与环丙沙星的浓度呈良好的线性关系,检出限为3.50×10^(-7)mol·L^(-1)(S/N=3)。该电化学传感器具有良好的重复性、稳定性和抗干扰性,可用于实际水体中环丙沙星的测定,加标回收率为95.7%~103.5%。

刈割对滇西北退化高寒草甸植物化学计量特征的影响

为探究环境干扰对退化高寒草甸植物化学计量特征的影响,该研究于2018—2020年对香格里拉市3个退化程度[轻度退化(LD)、中度退化(MD)、重度退化(SD)]的高寒草甸开展刈割试验,进而分析退化高寒草甸植物C、N、P含量、C∶N∶P和N-P幂函数关系在不同刈割年限(0、1、2 a)之间的差异。结果表明:(1)除莎草科P含量外,草甸植物群落、禾本科和杂类草的C、N、P含量在退化程度间无显著差异(P>0.05)。随着刈割年限的增加,退化草甸植物C、N、P含量呈先增后降的趋势(P<0.05)。(2)草甸植物C∶N和C∶P在退化程度间无差异(P>0.05)。从LD到SD,植物群落、莎草科和杂类草的N∶P比先小幅下降再显著上升(P<0.05),禾本科的N∶P未发生显著变化(P>0.05)。(3)随刈割年限增加,草甸植物的C∶N和C∶P呈先降后增、N∶P呈先增后降的趋势。刈割0 a时,莎草科的C∶P和N∶P显著高于杂类草(P<0.05),与植物群落和禾本科无差异(P>0.05);刈割1 a和2 a时,莎草科的C∶P和N∶P高于植物群落和其他功能群(P<0.05);在各刈割年限,植物群落和各功能群植物间的C∶N无差异(P>0.05)。(4)随刈割年限增加,退化草甸植物的N-P幂函数关系由弱变强、幂指数趋于稳定。莎草科的N-P幂指数(小于0.1)与植物群落、禾本科和杂类草的幂指数(稳定在0.19~0.22之间)明显不同。该研究发现,刈割干扰下退化高寒草甸植物生态化学计量特征在退化程度间差异不大,但其随刈割年限增加发生显著变化,这说明滇西北不同退化程度高寒草甸对刈割干扰可能具有相似的响应过程。

一种基于高压静电纺丝工艺制备的P(VDF-TrFE)/PZT压电传感器及其在睡眠监测中的应用

针对日常睡眠监测的需求,提出一种基于高压静电纺丝工艺制备的P(VDF-TrFE)/锆钛酸铅(PZT)压电传感器并对其性能进行了研究。首先,介绍了P(VDF-TrFE)/PZT压电传感器的制作及封装流程。其次对其灵敏度,频率响应特性,瞬时响应和稳定性等进行了测试。结果表明,该传感器不仅具有良好的微观外貌形态,且相比于纯P(VDF-TrFE)压电传感器0.73 V/N的灵敏度,制备的含30%PZT的P(VDF-TrFE)/PZT压电传感器灵敏度是纯P(VDF-TrFE)压电传感器的2.5倍,达到了1.78 V/N。此外在低频下能够保持稳定压电输出且具备2 ms较快的响应时间。最后采用自制的P(VDF-TrFE)/PZT压电传感器测量人体心冲击信号,并通过支持向量机(SVM)训练睡眠分期模型实现了对睡眠质量的监测,四分类模型平均准确率达到72.5%,为可穿戴睡眠监测传感器的选择提供了参考。

综合公园空间布局优化的模型构建及实证分析

综合公园作为重要且稀缺的城市公共资源,其合理布局对城市存量更新背景下优化公园体系、增进民生福祉具有重要意义。布局优化模型常用于解决公共服务设施布局问题,新重力P中值模型是一种综合多目标导向、设施供需匹配关系和复杂约束条件的布局优化方法。在辨析新重力P中值模型的基础上,综合考虑供给主体差异和模型求解难度,构建出面向城市综合公园布局优化的改进新重力P中值模型,主要修正内容如下:(1)通过细化供给主体,改良规模分配规则,改进新重力P中值模型未考虑现有公园和新建公园服务供给差异性的局限;(2)引入遗传算法寻优,解决非线性、多约束的复杂设施布局问题,实现模型求解以促进模型在公园实际规划中的推广应用。以苏州市中心城区为例,以多源数据为支撑,将研究尺度下沉至居住区尺度,实证结果表明模型优化后居民至邻近综合公园最大出行成本、平均出行成本和可达性基尼系数等指标均有改善,综合公园空间布局更为合理。研究结果可为综合公园布局规划提供有效决策工具,为公园绿地的精准化布局提供参考。

基于脑电信息的图感认知响应规律及其量化分析方法

“图”是人类感知世界的重要媒介,图感认知是大脑认知思维中平面图元与三维形体间形成有效转换的关键通道,但人脑在接受图形输入、完成认知处理并实现知识输出的过程是认知心理学和脑科学交叉学科。目前缺乏充分的研究方法和理论基础,因此针对图感认知过程不清晰及认知分析方法缺乏等问题,根据认知事件的脑电位相关性理论,以二维投影图和三维模型为图感认知对象,设计脑电认知测试实验并分析P300电位变化情况。结果表明:图感认知相关部位主要为大脑的前半部分左额叶位置;P300电位值可以用于反映大脑的图感认知程度,大脑对图像内容的接受能力越强,P300电位峰值越低。对比不同样本P300电位变化,可对图感认知过程进行分析,形成对图感认知能力的量化分析方法,提高图感认知内容对大脑的输入效率,对揭示图感输入和认知机理具有启示意义,并为图像交互深度应用反馈优化提供有效依据。