肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段 ,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础。采用PCR扩增方法获取P1结构基因。扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化 ,回收 1kb大小的DNA片段并与 pUC19DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。用X gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株 ,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定。经PCR扩增MPDNA获得 1条 5 .0kbDNA片段。重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出 2条带 ,1条为pUC19载体DNA带 ,另 1条是 1kb的插入片段。实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株。

肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆与鉴定

目的 :在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,为实现肺炎支原体P1蛋白结构基因的大量扩增及表达奠定基础。方法 :PCR方法获取肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,并与 pUC19载体DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。X -Gal平板筛选转化子 ,用PCR方法和限制性核酸内切酶酶切图谱分析方法鉴定重组克隆。结果 :PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1蛋白基因。结论 :获得了含有肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆菌株。

肺炎支原体P1蛋白结构基因片段的制备及C末端基因片段克隆的研究

目的 制备肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,并在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白C末端基因片段 ,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨C末端基因片段功能打基础。方法 PCR扩增方法获取P1结构基因。扩增产物用P1蛋白基因特异引物扩增鉴定。用SalⅠ和EcoRⅠ双酶酶切消化方法制备P1蛋白C末端基因片段 ,并与pUC19DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。用X - gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株 ,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定。 结果 经PCR扩增MPDNA获得一条 5 .0kbDNA片段 ,用P1基因区特异引物扩增鉴定获得阳性结果。重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出两条带 ,一条为 pUC19载体DNA带 ,另一条是 1kb的插入片段。

茎瘤芥酸性核糖体蛋白P1基因的克隆与序列分析

以茎瘤芥幼苗叶片总RNA为模板,通过SMART RACE技术进行反转录和PCR扩增,克隆到瘤芥酸性核糖体蛋白P1基因(命名为BjARPP1,GenBank登录号:JX282179),并利用ProtParam、DNAMAN等生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析。结果表明,茎瘤芥酸性核糖体蛋白P1基因开放阅读框为342 bp,编码113个氨基酸,等电点为4.27,相对分子质量为11.25 ku;二级结构预测显示α-螺旋占53.98%、不规则卷曲占33.68%、延伸链占12.39%,还含有5个磷酸化位点;同源进化树预测分析其与拟南芥的同源性为96%,与其他物种同源性低。茎瘤芥酸性核糖体蛋白P1基因为首次克隆,为进一步研究该基因的结构、功能、遗传变异规律以及其与生产性能的关系提供科学依据。

八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1有2个亚型

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白(P0、P1、P2)位于核糖体60S大亚基上,它们在核糖体上共同组成一个向外侧凸出的五聚体的柄状复合物[P0·(P1·P2)2],该复合物在蛋白质合成延伸过程中起着重要作用.为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物的组成形式及在蛋白质合成中的作用,对八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)的P1进行了研究.通过生物信息学方法,分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,找到2个酸性核糖体蛋白P1基因,从DNA和c DNA中都扩增到这2个P1基因,表明八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1确实存在2个亚型.将2个基因克隆后分别构建重组表达质粒p ET28a-P1A和p GEX-6P-1-P1B,在大肠杆菌BL21中获得高效表达.经镍柱和GST柱亲和层析后,获得较高纯度的八肋游仆虫酸性核糖体蛋白Eo P1A和Eo P1B,表达产物经Western印迹检测为阳性.Pull-down分析了Eo P1A和Eo P1B之间的相互作用.结果表明,游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1的2个亚型Eo P1A和Eo P1B之间存在相互作用.

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G +C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。

通用型动物转基因载体的构建及验证

为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有Xho I、Sal I、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe I、Cla I、Sac I位点。酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确。pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达。遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600"g/ml。pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点。

EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达

目的构建噬菌体P1Cre重组酶真核表达重组质粒,检测其在体外的表达情况和生物学活性。方法利用分子克隆技术,将cre编码序列克隆到真核表达质粒pIRES2-EGFP上,构建为重组质粒pCMV-Cre-EGFP。行菌液PCR、BamHⅠ酶切及测序鉴定,用FuGENE6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre重组酶的表达和重组效应。结果经菌液PCR、酶切及测序等鉴定分析,证实已将目的片段cre插入pIRES2-EGFP的多克隆位点上;建立Cre(+)组(pCMV-Cre-EGFP和含Loxp-CMV-RFP-Loxp的pCSilencer质粒)和Cre(-)组(pIRES2-EGFP和pCSilencer),转染293T细胞,48h后荧光显微镜下可见2组均表达绿色荧光和红色荧光,Cre(+)组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,统计学分析显示2组细胞的红色荧光蛋白表达率存在显著性差异(P<0.01)。结论成功构建噬菌体P1Cre重组酶表达重组质粒,并能在体外表达具有活性的Cre重组酶。

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中的表达及应用研究

目的：克隆、表达和鉴定肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）P1蛋白羧基端基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段并测序的基础上,将基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/P1（3520~4563bp）,转化大肠杆rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用ELISA和Western blotting方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白质纯度达95%以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获得两株高效价单克隆抗体。结论：本研究成功克隆和表达了肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,制备了抗肺炎支原体P1蛋白单克隆抗体,为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。

国人NLRP3和GSTP1基因多态性与慢性阻塞性肺疾病易感性研究进展

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以气流受限为特征的肺部疾病,其发病率和病死率较高、致病因素较复杂,主要是由遗传因素和环境因素共同作用所致。其发病机制主要以炎症机制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡以及氧化-抗氧化失衡3种假说为主。GSTP1作为抗氧化酶在肺脏中具有重要的抗氧化作用,但由于GSTP1基因具有多态性,使得GSTP1的抗氧化能力显著降低,导致体内氧化-抗氧化失衡,从而认为GSTP1基因多态性是COPD的危险因素之一;NLRP3作为炎性小体构成组分被证实参与COPD的炎症反应,而其基因多态性可使NLRP3结构发生改变从而可能影响COPD的发生。现对GSTP1和NLRP3基因多态性与COPD的相关性作一综述,以期在此基础上通过相关实验佐证为COPD的干预及靶向治疗提供新途径和新思路。