禽呼肠孤病毒(ARV)p10蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了深入研究禽呼肠孤病毒(ARV)的致病机理,从其基因组中克隆病毒非结构蛋白p10基因,并将其与原核表达载体连接,转入大肠杆菌BL21中,使其表达携带His标签的p10融合蛋白,经镍柱纯化得到高纯度重组p10蛋白,以该蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过3次亚克隆后获得2株能够稳定分泌针对p10蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2B12与4H10。通过间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法测定其腹水效价均为1:1.01×10~7,亲合力解离常数(kD)分别为3.91×10^(-10)、5.75×10^(-10),2株单抗的IgG亚型均为IgG2b。经Western Blot鉴定,该2株抗体均能特异性识别ARV感染DF-1细胞中的p10蛋白。这些单抗的制备为深入研究ARV的致病机理奠定了基础。

基于非洲猪瘟病毒p10蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立1种快速、高效和高通量检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,构建重组质粒pET-28a(+)-p10,通过原核表达系统获得重组p10蛋白,并将其作为包被抗原,构建检测ASFV抗体的间接ELISA方法。结果显示:重组p10蛋白以可溶性和包涵体2种方式表达,分子质量为12 ku,反应原性良好;建立的间接ELISA抗体检测方法最佳反应条件为:1μg/mL抗原4℃包被12 h,50 mg/mL BSA37℃封闭2 h,待检血清孵育0.5 h,底物显色4 min;试验依据S/P值判定阴阳性的临界值为0.388;建立的间接ELISA方法阳性血清的最低检测限为1∶800;与其他常见的猪病阳性血清无交叉反应;批内和批间变异系数均小于10%;与商品化试剂盒的总体符合率为90.38%。研究表明,建立的基于p10表达蛋白的ASFV抗体检测方法具有良好的灵敏性、特异性、重复性和符合率,具有较强的临床应用价值,为ASFV血清学诊断试剂的研发提供了参考。

非洲猪瘟病毒亲核结构蛋白p10可溶性表达及多克隆抗体制备

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒(ASFV)亲核结构蛋白p10,IPTG诱导可表达可溶性重组蛋白p10,分子量约为30 ku。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得重组蛋白p10,且重组蛋白可与ASF阳性血清发生特异性反应。将纯化后的p10作为抗原免疫新西兰白兔,分离血清并分析其反应特异性。ELISA检测结果表明,使用重组蛋白p10包被时,所得兔抗血清的效价可达1:204800;使用ASFV病毒裂解物包被,所得兔抗血清的效价可达1:400;表明制备的多克隆抗体能同时与原核表达和ASFV全病毒蛋白反应。IFA检测结果进一步印证多克隆抗体能与ASFV发生特异性反应,表明该抗体具有良好的反应活性和特异性。综上所述,重组p10蛋白和多克隆抗体可为后续建立针对ASFV抗原、抗体的检测方法提供重要的生物材料。

禽呼肠病毒P10、P17非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank上的禽呼肠病毒（ARV）S1基因序列，设计并合成了一对跨越P10和P17非结构蛋白基因的特异性引物，对13个ARV毒株进行RT—PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示，13个ARV毒株的P10蛋白基因ORF全长均为297bp，编码98个氨基酸；P17蛋白基因ORF全长为441bp，编码146个氨基酸。这13个ARV毒株P10、P17蛋白基因核苷酸同源性分别在96．6%～100%和95．2％～99．3%之间，推导的氨基酸同源性分别在98．2％～100%和91．9%～99．0%之间。将这13个ARV毒株与Gen Bank上其他正呼肠病毒毒株，包括番鸭株（DRV）和飞狐上分离到的内尔森海湾病毒（Nelson Bay Vir US，NBV）及两个澳洲分离株（ARM—1和SOM-4）进行同源性比较和遗传进化树分析，结果表明，呼肠病毒有地域和种类的差别。

禽呼肠孤病毒分离株P10、P17、δ3蛋白基因的表达及抗血清的制备

禽呼肠孤病毒的感染在我国鸡群中非常普遍，它除了可引起鸡传染性关节炎外，还可能引起矮小综合症和免疫抑制等。从鸡群中分离到的不同毒株ARV的毒力差别较大，抗原性也不尽相同。ARV是一种双股RNA病毒，病毒颗粒中的基因组有10个不同的独立节段组成。

与南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10互作的寄主因子筛选

为找到水稻中与南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)外壳蛋白P10(CP)相互作用的寄主蛋白,利用P10筛选水稻膜系统酵母双杂cDNA文库,寻找水稻中与P10互作的蛋白并结合生物信息学技术进行分析,回转验证。结果表明,筛选到10个可能与P10互作的水稻寄主蛋白,如胚发育晚期丰富蛋白Lea14-A、硫氧还原蛋白TRXh1、铁硫结合蛋白IscA以及真核生物起始翻译因子eIF-5A等。这些蛋白的发现说明水稻受到病毒侵染时,生长发育与营养物质的合成均受到影响。本研究结果为后续进一步研究P10蛋白的功能及其致病机制提供了理论依据。

Naa10p和CEA在唾液中联合检测对口腔鳞癌的诊断价值

目的:探讨N端α位乙酰基转移酶10蛋白(N-α-acetyltransferase 10 protein,Naa10p)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)联合检测在口腔鳞癌诊断中的临床价值。方法:采用ELISA法测定60例口腔鳞癌患者、30例癌前病变患者、40例正常人唾液中Naa10p、CEA的含量。用SPSS 17.0软件分析数据,评价其诊断价值。结果:口腔鳞癌组唾液中Naa10p、CEA的表达显著高于癌前病变组和正常对照组(P<0.05)。唾液中Naa10p、CEA单项和联合检测时的灵敏度、特异度、准确度分别为75.00%、82.50%和78.00%,70.00%、74.28%和72.00%,92.50%、72.79%和84.62%。Ⅰ、Ⅱ期口腔鳞癌患者Naa10p、CEA单项检测的阳性率分别为75.76%、69.69%,二者联合检测诊断的阳性率为90.91%。Naa10p、CEA的ROC曲线下面积分别为0.822、0.736,联合检测的ROC曲线下面积为0.911(P<0.05)。结论:唾液中的Naa10p作为肿瘤标志物检测口腔鳞癌更优于唾液中的CEA,唾液中Naa10p和CEA联合检测有助于提高口腔鳞癌的诊断性能和早期检出率。

家蚕蛋白亚细胞定位预测模型的构建及其初步应用

为研究家蚕蛋白及家蚕杆状病毒蛋白的亚细胞定位并提高预测模型的特异性和准确率,构建了家蚕蛋白亚细胞定位预测模型,并将该模型初步应用于家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10蛋白的亚细胞定位预测中。结果表明,总体预测准确率在不分段时为60.6%,分两段、三段和四段时分别为78.9%、78.4%和80.6%;对BmNPV P10蛋白的预测结果为宿主细胞核,通过免疫细胞荧光实验对预测结果进行验证,结果表明预测结果与实际相符。因此,采用分段的方法能够提高预测准确率,且家蚕病毒蛋白可以利用其宿主家蚕蛋白亚细胞定位预测模型进行亚细胞定位。

SARS-CoV核蛋白和宿主细胞相互作用的初步研究

寻找与SARS-CoV核蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,从而探索SARS-CoV的致病机理。可溶性表达SARS-CoV核蛋白,利用His标签和离子交换层析对表达的蛋白进行了纯化,获得较纯的可溶性核蛋白。再将SPR/BIA技术与MALDI-TOF MS技术结合起来,使用SPR生物传感芯片作为亲和吸附的表面,分别捕获2BS细胞和A549细胞裂解液中与SARS-CoV核蛋白相互作用的细胞蛋白,收集足够量的相互作用蛋白,再利用MALDI-TOF-MS分析获得蛋白的性质。结果鉴定出与SARS-CoV核蛋白相互作用的蛋白:26S蛋白酶调节亚单位S10B(蛋白酶体亚单位p42)(蛋白酶体26S亚单位ATPase 6)(P62333),属于泛素/蛋白酶体系统;目前国内外尚未见类似报道。此研究初步发现了一种与SARS-CoV核蛋白在细胞外相互作用的蛋白,但这种相互作用在SARS-CoV感染及SARS的发生发展中发挥的作用还有待于深入研究和探索。

禽源呼肠孤病毒S1基因节段分子生物学研究进展

呼肠孤病毒广泛的宿主性以及自身基因组的结构特征使其在进化过程中呈现遗传多样性,新型禽源呼肠孤病毒在此过程中不断出现,引起家禽和水禽养殖业的严重经济损失。其中,关于S1基因节段的科学研究对于理解病毒致病性改变以及疫苗开发有关键作用。因此,本文拟就禽源呼肠孤病毒的发生、S1基因的结构及其编码的非结构蛋白P10、P17和结构蛋白σC的生物学功能最新研究进展作一概述。

TMED10对骨关节炎中TGF-β/Smads信号通路的影响

目的:探究跨膜P24转运蛋白10(TMED10)对骨关节炎中转化生长因子-β(TGF-β)/Smads信号通路的影响。方法:将大鼠软骨细胞分为Control组、IL-1β组、NC-sh+IL-1β组、TMED10-sh+IL-1β组、NC-OE+IL-1β组和TMED10-OE+IL-1β组。Control组和IL-1β组细胞不进行转染处理,NC-sh+IL-1β组、TMED10-sh+IL-1β组、NC-OE+IL-1β组和TMED10-OE+IL-1β组细胞分别转染NC-sh、TMED10-sh、NC-OE和TMED10-OE。转染后,除Control组之外,其他组软骨细胞均用白介素-1β(IL-1β)(10 ng/mL)处理24 h模拟OA软骨细胞的病理微环境。通过MTT法检测细胞增殖,通过TUNEL法检测细胞凋亡。采用前交叉韧带切断加内侧半月板部分切除法建立OA大鼠模型,将OA大鼠分为OA组、OA+NC-sh组和OA+TMED10-sh组(n=12),Sham组(n=12)大鼠进行假手术操作。Sham组和OA组大鼠关节腔内注射40μL生理盐水,OA+NC-sh组和OA+TMED10-sh组大鼠关节腔内分别注射40μL的NC-sh和TMED10-sh(滴度为1×10^(9)TU/m L),每周注射1次,共4周。采用番红O/固绿染色法评价膝关节软骨形态,采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡。采用RT-qPCR检测软骨细胞和大鼠关节软骨中TMED10的m RNA水平,采用Western blot检测软骨细胞和大鼠关节软骨中TMED10、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Collagen II和MMP-13的蛋白表达水平。结果:与Control组比较,IL-1β组TUNEL阳性率、TMED10 m RNA和TMED10、MMP-13蛋白水平均升高(P<0.05),相对细胞活力以及TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和Collagen II的蛋白水平均降低(P<0.05)。与IL-1β组和NC-sh+IL-1β组比较,TMED10-sh+IL-1β组TUNEL阳性率、TMED10 m RNA水平和TMED10、MMP-13的蛋白水平均降低(P<0.05),相对细胞活力以及TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和Collagen II的蛋白水平均升高(P<0.05)。与IL-1β组和NC-OE+IL-1β组比较,TMED10-OE+IL-1β组TUNEL阳性率、TMED10 m RNA水平和TMED10、MMP-13的蛋白水平均升高(P<0.05),相对细胞活力以及TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和Collagen II的蛋白水平均降低(P<0.05)。与Sham组比较,OA组大鼠的OARSI评分、TUNEL阳性率、TMED10 m RNA水平以及TMED10和MMP-13的蛋白水平均升高(P<0.05),TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和Collagen II蛋白水平均降低(P<0.05)。与OA组和OA+NC-sh组比较,OA+TMED10-sh组大鼠的OARSI评分、TUNEL阳性率、TMED10 m RNA水平以及TMED10和MMP-13的蛋白水平均降低(P<0.05),TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和Collagen II蛋白水平均升高(P<0.05)。结论:本研究表明TMED10可能通过抑制TGF-β/Smads信号通路导致软骨细胞丢失和软骨退变,TMED10/TGF-β/Smads信号通路可能是治疗OA的新靶标。