基于重组P113蛋白的山羊抗绵羊肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

绵羊肺炎支原体(MO)是引起绵羊、山羊等小反刍动物非典型肺炎的病原。为建立基于黏附素P113蛋白的检测MO抗体的间接ELISA方法,本研究采用原核表达并纯化的MO重组P113蛋白(rP113)作为包被抗原,经优化条件后建立了间接ELISA方法(rP113-ELISA),并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。特异性试验结果显示该方法对MO之外的常见支原体和其他病原的抗体检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,13200稀释的阳性血清仍能检出,敏感性高。该方法重复性试验结果显示组内和组间变异系数均小于5%,重复性较好。利用rP113-ELISA和间接血凝方法(IHA)对MO疫苗免疫山羊的抗体和80份临床样品进行检测,结果显示检测MO疫苗免疫抗体的消长规律结果与IHA检测结果一致;对80份临床山羊血清样品检测结果与IHA检测结果阳性符合率为87.5%,阴性符合率为82.1%,rP113-ELISA敏感性高于IHA。本研究为MO抗体检测提供了一种特异、灵敏和稳定的方法。

9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因克隆及蛋白序列分析

[目的]克隆绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因,比对、分析不同菌株P113蛋白序列,为研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的生物学功能提供参考。[方法]设计绵羊肺炎支原体P113基因特异性引物,采用PCR方法扩增9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株的P113基因片段;对获得的9株绵羊肺炎支原体P113基因片段进行测序分析,将DNA序列翻译为氨基酸序列,对不同菌株的P113氨基酸序列进行比对。[结果]不同分离株P113基因片段扩增产物大小不同。氨基酸序列分析显示,C末端序列重复区域长度存在差异,以KKAEGA(S)QNQG为主要重复序列单元。不同菌株重复序列单元数量不同,NM01-MO株和CK-MO株的重复序列单元数量最多,为16个;LK-MO株重复序列单元数量最少,为3个;多数菌株之间重复序列单元数量差异较大。[结论]绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113氨基酸序列的C末端重复序列单元数量不同,这些不同数量的重复序列影响P113蛋白结构,进而可能影响其生物学功能。

绵羊肺炎支原体P113蛋白C端重复区的表达及其免疫原性

为进一步研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的结构与功能,在进行生物信息学分析的基础上,对编码其C端重复区的基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blotting方法对P113蛋白的免疫原性进行了分析。结果显示,P113蛋白与猪肺炎支原体黏附素P97蛋白高度同源,并具有相似的C端重复区;该区域在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以可溶性的形式存在;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P113蛋白是良好的免疫原。

绵羊肺炎支原体P113蛋白C末端基因真核表达载体的构建及其小鼠免疫应答

为探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)P113蛋白小鼠免疫应答情况。构建了Mo P113蛋白C末端基因pVAX1-P113表达质粒,转染至MDBK细胞,应用PCR技术及间接免疫荧光试验评价其体外表达效果;免疫实验动物BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法分析重组质粒诱导小鼠特异性抗体和细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)分泌情况。结果显示,成功构建含Mo P113基因重组真核表达质粒pVAX1-P113,重组质粒转染MDBK细胞能有效转录并表达目的蛋白;小鼠免疫试验结果显示重组质粒pVAX1-P113免疫小鼠后血清特异性抗体水平显著升高,在免疫7周时血清特异性抗体仍为阳性;血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平显著升高,并在时间上呈先上升后下降的趋势;在不同试验组之间特异性抗体、IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌量也存在显著性差异,pVAX1-P113(100μg)组分泌水平显著高于其他试验组。结果表明,重组质粒pVAX1-P113能诱导免疫小鼠产生免疫应答;为羊支原体肺炎(MPSG)核酸疫苗研究与应用提供了依据。

绵羊肺炎支原体P113蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫荧光检测中的应用研究

P113蛋白是绵羊肺炎支原体重要的免疫原。为了制备针对P113蛋白的单克隆抗体,本研究以原核表达的重组P113蛋白免疫小鼠,制备了1株P113蛋白的特异性单克隆抗体C426,纯化后用异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体,并建立了绵羊肺炎支原体的免疫荧光检测技术。结果显示,该株单克隆抗体的ELISA效价为1∶128 000,亚型为IgG2b,轻链类型为κ型,并具有良好的特异性。所建立的免疫荧光检测方法特异性强、灵敏度高,其对绵羊肺炎支原体培养物的检测下限为100 CCU/m L。该方法可以从感染动物的鼻拭子样品或肺组织中成功检测到绵羊肺炎支原体,与PCR方法的阳性符合率为86.25%,明显高于支原体分离培养的方法。本研究制备的P113蛋白单克隆抗体以及免疫荧光技术不仅为绵羊肺炎支原体感染的诊断提供了新的手段,同时为进一步研究P113的功能提供了良好的工具。