miR-535靶向GAB2基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进山羊颗粒细胞增殖

【背景】MicroRNA(miRNA)是长度为18—25 nt的短RNA分子,在哺乳动物卵巢颗粒细胞调控卵泡发育过程中起着重要作用。团队前期对云上黑山羊高、低产羔数个体卵巢转录组测序结果显示,miR-535能够影响山羊产羔数,但具体调控机制尚不清楚。【目的】通过研究miR-535靶向GAB2(GRB2 associated binding protein 2)及其相关信号通路PI3K/AKT对山羊颗粒细胞增殖的影响,进一步探讨其分子生物学调控机制。【方法】在本研究中,选择具有两胎以上产羔记录的高、低产云上黑山羊各3只,同期发情处理后采集卵泡期卵巢组织,收集原代颗粒细胞。使用荧光定量PCR(reverse transcription-quantitativePCR,RT-qPCR)检测miR-535和GAB2在云上黑山羊高、低产卵巢组织中的表达量。构建GAB2的过表达/干扰载体,使用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、CCK8、EdU和细胞凋亡检测候选基因GAB2对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响。使用miRDB和miRanda软件预测miR-535和GAB2的靶向关系,构建GAB2的野生型和突变型载体,利用双荧光素酶活性检验检测miR-535和GAB2的靶向关系。构建过表达/干扰miR-535载体,探究其颗粒细胞增殖及下游基因功能的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,GAB2在高产云上黑山羊卵巢组织中的表达量显著低于低产个体,miR-535的表达则相反(P<0.05);随后,RT-qPCR和Westernblot结果表明,在颗粒细胞中过表达GAB2后,CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著升高(P<0.05),BAX的表达量显著降低(P<0.05),抑制其表达则与之相反;EdU和CCK8检测显示,GAB2过表达后显著促进颗粒细胞增殖(P<0.05),抑制其表达后则相反;双荧光素酶报告试验表明,miR-535抑制了GAB2基因3’UTR区域的双荧光素酶活性。RT-qPCR和Western blot结果显示,在颗粒细胞中过表达miR-535后,GAB2、CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著降低(P<0.05),BAX的表达量显著升高(P<0.05),抑制其表达后则与之相反;EdU和CCK8检测显示,miR-535过表达后抑制颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反;细胞凋亡试验表明,miR-535过表达后促进颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反。在颗粒细胞中抑制miR-535后,发现PI3K/AKT信号通路标志因子AKT1的表达水平显著升高(P<0.05)。【结论】miR-535通过抑制GAB2的表达,抑制了山羊颗粒细胞的增殖,为进一步探究miR-535调控山羊颗粒细胞的生物学功能提供了理论依据。

盐酸小檗碱通过P13K/AKT信号通路抑制MMP2和MMP9的表达影响膀胱癌T24细胞侵袭性

目的:探讨盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride)对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响及机制.方法:采用利用CCK8法检测膀胱癌T24细胞的生存率;transwell侵袭试验检测盐酸小檗碱对T24细胞侵袭能力的影响;Western-blotting分析盐酸小檗碱对P13K/AKT通路相关因子(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT),细胞基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)蛋白表达的改变.结果:CCK8显示盐酸小檗碱对T24细胞的增殖抑制呈浓度和时间依赖性(P<0.05);与对照组比较,经盐酸小檗碱处理后膀胱癌T24细胞侵袭能力明显降低.P13K抑制剂LY294002可通过抑制P13K/AKT通路活化,抑制MMP2和MMP9的表达,相对应的盐酸小檗碱处理后膀胱癌T24细胞p-PI3K、pAKT、MMP2、MMP9蛋白表达下降(P<0.05).结论:盐酸小檗碱可有效抑制膀胱癌T24细胞侵袭能力,其机制可能是通过调控P13K/AKT通路抑制MMP2和MMP9的表达.

基于网络药理学、分子对接和实验验证研究续断散加当归、骨碎补调控PI3K/AKT信号通路治疗激素性股骨头坏死的潜在机制

目的基于网络药理学、分子对接技术,结合动物实验验证探究续断散加当归、骨碎补(Teasel Root Sanjia Angelica Sinensis and Drynaria Rhizome,TASDR)对激素性股骨头坏死的治疗作用,并初步探讨其潜在作用机制。方法采用TCMSP数据库检索TASDR中各味中药的化学成分和中药靶点,利用GeneCards数据库筛选激素性股骨头坏死的作用靶点,通过String平台构建核心靶点基因的蛋白质PPI(蛋白质互相作用)网络,通过Omic-Share Tools进行GO、KEGG分析。使用AutoDock 1.5.6软件对所得靶点以及姜黄素进行分子对接验证。动物实验选取24只新西兰大白兔,分为空白组,模型组及高、低剂量药物干预组,从中选取18只建立醋酸泼尼松龙诱导的激素性股骨头坏死模型,各组采取相应的药物干预,采用HE染色、免疫组化、Western blot检测,比较TASDR在治疗激素性股骨头坏死过程中对PI3K/AKT信号通路中某些关键蛋白表达水平的影响。结果经过筛选后TASDR治疗激素性股骨头坏死潜在核心靶点38个,靶点包括TNF、IL-6、VEGFA等,此外TASDR作用靶点中包括AKT蛋白家族-AKT1。TASDR通过肿瘤信号通路、VEGF信号通路等通路,并涉及酶结合、受体结合等分子功能,参与程序性细胞凋亡、程序性细胞凋亡负调控等生物过程来调控成骨分化。分子对接显示TASDR与TNF、VEGF、AKT1等靶点基因的结合活性良好。动物实验结果表明:在模型组中,PI3K、AKT等蛋白呈现高表达,而下游蛋白FOXO1及VEGF表达量减少,经TASDR干预后PI3K及AKT等蛋白表达量下降,FOXO1及VEGF等蛋白表达升高。结论TASDR有着靶点、通路多元化的优势,可在一定程度上调控TNF、IL-6、VEGF、AKT1等靶点基因的表达,动物实验表明PI3K/AKT信号通路过度激活时,TASDR可一定程度上下调上游蛋白AKT及PI3K的表达量,且使得下游基因FOXO1及VEGF的表达量增加进而在激素性股骨头坏死的治疗中发挥作用。

miR-200b-5p靶向ATAD2调控P13K/AKT信号通路参与宫颈癌血管生成的作用机制

目的探究miR-200b-5p靶向调控ATAD2基因介导P13K/AKT信号通路对宫颈癌血管生成的作用机制。方法采集2016年3月至2018年3月间日照市妇幼保健院诊治的90例宫颈癌手术切除患者的术中标本作为研究对象。将采集到的标本行免疫组化检测,qRT-PCR检测组织miR-200b-5p、ATAD2表达,Western blot检测组织中ATAD2蛋白表达。细胞转染并分组,qRT-PCR检测各组细胞中miR-200b-5p、ATAD2、PI3K、AKT mRNA表达水平;Western blot检测ATAD2、PI3K、AKT、VEGF蛋白表达水平。体外管腔形成实验比较各组管腔数目。结果宫颈癌组织中miR-200b-5pmRNA低表达,ATAD2 mRNA表达水平及蛋白表达均呈高表达,差异均具有统计学意义(均P<0.05);并伴随高VEGF阳性表达率和MVD。细胞转染实验提示与Blank组和NC组相比,miR-200b-5p mimic组miR-200b-5p表达量显著升高,ATAD2、PI3K、AKT表达显著下降,差异均具有统计学意义(均P<0.05);miR-200b-5p mimic组和ATAD2siRNA组VEGF、ATAD2、PI3K、AKT蛋白表达水平均显著下降,差异均具有统计学意义(均P<0.05);且miR-200b-5p mimic+ATAD2siRNA组表达趋势相比miR-200b-5p mimic组更显著,差异均具有统计学意义(均P<0.05);而miR-200b-5p inhibitor组差异与之相反,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。体外管腔形成实验提示管腔数目变化miR-200b-5p inhibitor组显著上升,miR-200b-5p mimic+ATAD2siRNA组显著下降,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论促进miR-200b-5p表达,抑制ATAD2基因,抑制PI3K、AKT表达,从而抑制P13K/AKT信号通路,最终实现对人宫颈癌细胞血管生成的抑制。

盐酸坦索罗辛对前列腺增生大鼠P13K/Akt信号通路的影响

目的:探讨盐酸坦索罗辛对前列腺增生(BPH)大鼠P13K/Akt信号通路的影响。方法:将健康的雄性SD大鼠60只随机分为健康对照组、空白模型组和盐酸坦索罗辛高、中、低剂量组,每组12只。除健康对照组外,其余各组大鼠均采用去势术联合丙酸睾酮注射建立良性BPH模型。建模成功后,盐酸坦索罗辛高、中、低剂量组分别灌胃1 mL剂量为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.4 mg/mL的盐酸坦索罗辛配制溶液,健康对照组和空白模型组灌胃等体积的蒸馏水。治疗28 d后计算大鼠前列腺指数,苏木精-伊红(HE)染色观察前列腺组织病理改变,免疫组化超敏感SP法检测Ki-67蛋白的表达情况,利用Ki-67蛋白表达计算出细胞增殖指数。Western blotting检测前列腺PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量。实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测PI3K、Akt和mTOR蛋白mRNA相对表达量。结果:HE染色结果显示,健康对照组的大鼠前列腺结构完整,腺体和腺腔大小正常,腺上皮细胞排列整齐;建模各组大鼠前列腺腺体增生明显,腺腔缩小,腺上皮细胞皱褶增多,盐酸坦索罗辛高、中、低剂量组大鼠的前列腺腺体增生较空白模型组大鼠明显减少,盐酸坦索罗辛中剂量组改善程度明显优于盐酸坦索罗辛低剂量组、高剂量组。各组大鼠前列腺指数、P13K/Akt信号通路相关蛋白表达和细胞增殖指数比较,均具有显著差异(均P<0.01),盐酸坦索罗辛高、中、低剂量组比健康对照组高(P<0.05),且比空白模型组低(P<0.05),盐酸坦索罗辛中剂量组表现更明显。p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量与前列腺指数呈正相关关系(P<0.05)。结论:盐酸坦索罗辛能抑制前列腺细胞增殖,有效改善BPH模型大鼠前列腺组织增生,其可能作用机制与抑制PI3K/Akt信号通路表达相关。

原花青素B2通过调控P13K/Akt/Nrf2信号通路减轻氯氰菊酯所致神经元损伤

目的探讨原花青素B2(PCB2)是否通过调控P13K/Akt/Nrf2信号通路保护氯氰菊酯(CYP)导致的神经元氧化损伤。方法原代培养C57BL/6小鼠大脑皮层神经元,将细胞随机分成5组:正常对照组;PCB2处理组(将5μg/mL的PCB2与细胞共培养24 h);CYP暴露组(将50μmol/L的CYP与细胞共培养24 h);PCB2预处理组(将5μg/mL的PCB2与细胞预处理30 min后加入CYP 50μmol/L共培养24 h);LY294002处理组(先将20μmol/L的LY294002与细胞预处理30 min,然后加入PCB2预处理30 min,后与CYP共培养24 h)。采用CCK-8分析各组细胞活性,采用荧光探针DCFH-DA及流式细胞术检测细胞内ROS水平,通过Hoechst 33342观察细胞核形态变化,采用JC-1检测线粒体膜电位异常,利用Western blot检测Nrf2、HO-1、p-Akt、Akt蛋白表达。结果CYP暴露降低细胞活性(P<0.001),引起线粒体膜电位下降、促使细胞核出现固缩、浓染等凋亡特征,导致ROS产生异常。PCB2预处理提高细胞存活率(P=0.006),改善细胞核形态异常,逆转CYP导致的线粒体膜电位下降,减弱细胞内ROS产生。CYP暴露引起Nrf2核易位,Nrf2、HO-1、p-Akt蛋白表达上调(P<0.001)。PCB2预处理调节Nrf2、HO-1、p-Akt蛋白过度表达。抑制P13K/Akt信号通路消除了PCB2对CYP诱导损伤的保护作用(P<0.05)。结论PCB2通过激活P13K/Akt信号通路,调控Nrf2/ARE通路,减轻CYP所致小鼠大脑皮层神经元氧化损伤。

P13K细胞信号转导通路和肝癌发病的关系研究

肝癌是我国常见的消化道肿瘤,在临床肿瘤的相关死亡原因中居第2位。肝癌恶性程度高,临床特异性低,致使多数患者确诊时大多已属晚期,失去了手术机会[1]。传统的化疗、放疗对肝癌疗效欠佳,有必要寻找新的治疗方法或药物,而靶向治疗药物正是其中的热点之一。原发性肝癌的发生发展过程是肝细胞过度增殖和细胞凋亡受抑制的过程[2],如能诱发肝癌细胞凋亡而不损伤正常细胞、组织、

PTEN和mTOR蛋白在IDH1基因分型胶质母细胞瘤及P13K/Akt/mTOR信号通路中的表达及其相关性

目的研究P13K/Akt/mTOR信号通路中PTEN和mTOR蛋白在IDH1基因分型-突变型与野生型胶质母细胞瘤中的表达及意义。方法采用免疫组化方法检测胶质母细胞瘤手术后组织标本共52例(其中IDH1突变型胶质母细胞瘤10例,IDH1野生型胶质母细胞瘤42例),检测PTEN和mTOR蛋白在这两种不同基因分型胶质母细胞瘤中的表达情况及相关性。结果PTEN蛋白在IDH1突变型与野生型胶质母细胞瘤的表达率分别为20.00%(2/10)和73.81%(31/42),mTOR蛋白的表达率分别为70.00%(7/10)及35.71%(15/42),PTEN和mTOR蛋白在IDH1两种基因分型的胶质母细胞瘤的表达差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。PTEN和mTOR的表达呈负相关关系(r=-0.724,P<0.01)。结论 PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中两个位点调节因子PTEN及mTOR在IDH1突变型与野生型GBM中分别表达降低及增高,且两种蛋白表达呈负相关的关系,提示PTEN和mTOR在IDH1突变型与野生型胶质母细胞瘤的分子通路中扮演着重要的调控作用。

基于PI3K/Akt信号通路探索益气活血祛风通络法治疗糖尿病肾病的作用机制

目的基于PI3K/Akt信号通路探索益气活血祛风通络法治疗糖尿病肾病的分子机制。方法 40只GK大鼠,随机分为模型组、假手术组、益气活血组、祛风通络组、益气活血祛风通络(全方)组,每组8只。糖尿病肾病模型通过高脂高糖喂养加单肾切除术复制。益气活血组、祛风通络组、全方组分别给予益气活血颗粒、祛风通络颗粒、益气活血祛风通络颗粒,模型组、假手术组给予纯净水。干预8周,观察大鼠在干预后肾脏的病理改变以及24小时尿蛋白变化,同时肾脏组织的pPI3K、p-Akt和PTEN的表达情况采用Western blotting以及免疫组化法检测,PI3K mRNA、Akt mRNA以及PTEN mRNA的表达水平采用RT-PCR法检测。结果 HE染色结果显示,中药干预的大鼠肾小管上皮细胞空泡变性程度、纤维化以及肾小球硬化比模型组以及假手术组要轻,且在肾间质纤维化方面,全方组要好于益气活血组以及祛风通络组;PASM染色和Masson染色阳性率均显示益气活血组、祛风通络组、全方组阳性率明显低于模型组(P<0.01),但全方组阳性率与益气活血组以及祛风通络组无统计学差异(P>0.05);益气活血组、祛风通络组、全方组的24小时尿蛋白在中药干预后明显减少,而且与模型组对比具有显著性的差异(P<0.01)。Western blotting结果显示,中药干预的三组pPI3K、p-Akt的表达明显高于模型组(P<0.01),而PTEN的表达显著低于模型组(P<0.01)。免疫组化结果显示,p-PI3K、p-Akt在药物干预的三组表达显著低于模型组(P<0.05);PTEN在祛风通络组以及全方组的表达显著低于模型组(P<0.01),在活血化瘀组表达水平与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR结果显示PI3K mRNA、Akt mRNA在中药干预的三组均明显低于模型组(P<0.05),而PTEN mRNA的表达水平则显著高于模型组(P<0.01)。结论益气活血、祛风通络法治疗糖尿病肾病均可以起到降低蛋白尿、减轻肾间质纤维化以及延缓肾小球硬化的作用,二者结合在延缓肾间质纤维化方面效果更好,三者作用分子机制均可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关,且祛风通络法及益气活血祛风通络法抑制效果要略强于单独益气活血法。

荷芪散对多囊卵巢综合征大鼠内分泌代谢及PI3K/AKT信号通路的影响

目的观察荷芪散对多囊卵巢综合征大鼠内分泌代谢的影响和对PI3K/AKT信号通路的调控作用,探讨荷芪散防治多囊卵巢综合征的可能作用机制。方法从60只健康雌性SD中随机选取15只作为正常组,其余大鼠均采用颈背部皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)的方法建立多囊卵巢综合征模型,将造模成功大鼠随机分为模型组、荷芪散组、二甲双胍组,每组15只。荷芪散组和二甲双胍组分别给予相应药物灌胃,正常组和模型组均给予生理盐水灌胃。灌胃8周后,检测各组大鼠血糖指标[空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)]、血脂指标及性激素[黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)]水平,同时用HE染色法观察各组大鼠卵巢组织形态,采用RTPCR方法检测胰岛素受体底物-1(IRS-1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT-2(AKT-2)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、葡萄糖转运蛋白因子-4(GLUT-4)、人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)mRNA表达水平。结果荷芪散组、二甲双胍组FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明显低于模型组(P均<0.05),而HDL-C变化不明显(P>0.05);荷芪散组FPG、FINS、HOMA-IR与二甲双胍组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明显低于二甲双胍组(P均<0.05),而TC、FSH明显高于二甲双胍组(P均<0.05)。荷芪散组、二甲双胍组大鼠卵巢组织接近正常。荷芪散组、二甲双胍组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05),PTENmRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05);荷芪散组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4mRNA相对表达量均明显高于二甲双胍组(P均<0.05),PTENmRNA相对表达量明显低于二甲双胍组(P<0.05)。结论荷芪散可通过上调局部卵巢组织PI3K/AKT信号通路中相关重要信号传导分子的基因表达,下调拮抗因子的基因表达,改善多囊卵巢综合征模型大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗及卵巢组织形态。

PI3K/AKT/FOXO1信号通路参与复方中药CFF-1诱导的前列腺癌细胞凋亡和周期阻滞

目的:研究复方中药CFF-1诱导前列腺癌细胞的凋亡作用及其相关分子机制的探讨。方法:通过形态学观察、噻唑蓝(MTT)比色实验、CCK-8实验测定前列腺癌细胞的存活能力;采用DAPI染色法测定细胞核凝缩破裂;运用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定前列腺癌细胞的凋亡率。再通过PI单染流式细胞术测定前列腺癌细胞的周期变化;以及采用蛋白质免疫印迹实验检测PI3K/AKT/FOXO1信号通路以及其下游凋亡相关蛋白和周期相关蛋白的表达。结果:复方中药CFF-1使前列腺癌细胞周期阻滞在G1期,并呈浓度依赖性降低细胞的存活能力、增加细胞核凝缩破裂以及核小体的形成,显著提高前列腺癌细胞的凋亡率。在分子机制上,CFF-1呈现浓度依赖性下调PI3K/AKT活性,降低FOXO1磷酸化水平,进而上调FOXO1的转录活性,最终影响凋亡相关基因和周期相关基因的表达。结论:CFF-1对前列腺癌细胞的生长有显著的抑制作用,并且通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路诱导前列腺癌细胞周期阻滞并发生凋亡,对治疗前列腺癌具有潜在的临床应用价值。

PI3K/AKT信号通路在全肝缺血再灌注大鼠肺损伤中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路在大鼠全肝缺血再灌注肺损伤中作用。方法本实验分两部分。(1)36只大鼠分别于肝缺血前与再灌注后不同时点处死取肺。(2)12只大鼠分成Wortmannin组与模型对照组。分别应用Western blot、原位末端转移酶(TUNEL)法与免疫组化法检测肺AKT、磷酸化AKT(p-AKT)表达、细胞凋亡与增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果(1)与缺血前相比,缺血再灌注后肺细胞凋亡指数显著增高;p-AKT/AKT与PCNA阳性指数呈双相变化;肺病理改变严重。(2)p-AKT/AKT与PCNA阳性指数成正相关;与凋亡指数呈负相关。(3)与模型对照组相比,Wortmannin组p-AKT/AKT与PCNA阳性指数显著降低,细胞凋亡指数显著增高,病理改变加重。结论PI3K/AKT通路可能通过抑制凋亡、促进增殖对全肝缺血再灌注肺损伤发挥保护作用。

人神经母细胞瘤株SY5Y细胞PI3’K信号转导通路的研究

目的利用磷酸腺肌醇-3蛋白激酶(PI3’K)的特异性抑制剂Wortmannin阻断体外培养的人神经母细胞瘤株SY5Y细胞的信号转导通路,通过观察胰岛素对SY5Y生长的影响,研究其作用机制。方法体外培养SY5Y细胞,分为2大组,第1组包括:对照组、5mmol/L葡萄糖组、5mmol/L葡萄糖加胰岛素0.01U/mL组、5mmol/L葡萄糖加Wortmannin加胰岛素组;第2组包括:对照组、11.5mmol/L葡萄糖组、11.5mmol/L葡萄糖加胰岛素0.01U/mL组、11.5mmol/L葡萄糖加Wortmannin加胰岛素组。观察每组细胞的噻唑蓝(MTT)代谢率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞轴突长度和胞体面积,并进行统计学分析。结果胰岛素可使正常和高糖环境下SY5Y细胞MTT代谢率升高、LDH漏出率降低、SY5Y细胞轴突长度和胞体面积增加,但经Wortmannin作用后,其作用减弱。结论SY5Y细胞表面存在胰岛素受体,胰岛素通过激活SY5Y细胞的PI3’K信号转导通路发挥其神经保护作用。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在非小细胞肺癌中作用的研究进展

肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤,每年有超过100万人死于肺癌。PI3K/Akt通路在肿瘤治疗方面已经有了比较广泛的研究,活化受体酪氨酸激酶和它们下游信号递质的研究也已经为肺癌的治疗打开了一个非常有前景的领域。由于PI3K/Akt通路在下游多点活化受体酪氨酸激酶,因此被广泛地研究并开发新的抗肿瘤制剂。mTOR已经被确定是PI3K/Akt的下游靶点。雷帕霉素及其衍生物具有高度选择性,mTOR的抑制剂对于多种肿瘤的治疗效果已取得了很好的研究结果。在此我们将对肺癌中PI3K/Akt/mTOR信号通路的分子基础做一综述,并进一步讨论有关肺癌的多靶点治疗策略。

LPA经PI3K/Akt信号转导通路抑制顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡

目的研究PI3K/AKT信号转导通路对LPA保护顺铂诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡作用的影响。方法MTT法检测LPA和LY294002对DDP作用后的SKOV3细胞增殖活性的影响;Ho-echst33258荧光染色观察凋亡细胞;FCM分析细胞凋亡率;凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA"梯状"条带;Western blot检测LPA、LY294002对磷酸化Akt蛋白表达的影响。结果LPA+LY294002+DDP组对SKOV3细胞增殖的抑制作用、凋亡小体的产生及细胞凋亡率高于LPA+DDP组(P<0.05),而与LY294002+DDP组差异无统计学意义,DNA片段凝胶电泳示LPA作用后不产生明显的凋亡片段,LPA和LY294002同时作用可出现DNA断裂梯形条带。Western blot结果示LPA作用后磷酸化Akt蛋白表达升高,而LY294002作用后,磷酸化Akt蛋白表达明显下降。结论LPA通过激活PI3K/Akt信号转导通路抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡。

手霉素通过阻断PI3K／Akt信号通路诱导U937白血病细胞凋亡

目的:探讨手霉素对U937白血病细胞的作用及其机制。方法:2μmol/L的手霉素处理U937白血病细胞不同时间,分别使用Annexin V/PI试剂及ROS检测试剂标记细胞后,应用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内ROS生成,免疫印迹术检测PI3K、P-Akt、Akt等蛋白的表达。结果:与0 h对照组相比,随着处理时间的延长,手霉素诱导的U937细胞凋亡(P<0.05)及ROS生成逐渐增加(P<0.05),对PI3K/Akt信号通路活化的抑制逐渐增强。N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)(能有效抑制ROS产生的物质)可以阻断手霉素对U937细胞内PI3K/Akt信号通路的抑制及手霉素诱导的U937细胞凋亡。结论:手霉素通过诱导ROS产生进而抑制PI3K/Akt信号通路活化来诱导U937细胞凋亡。

雄激素受体基因对前列腺癌移植瘤生长及PI3K/AKT信号通路的影响

目的探讨雄激素受体(AR)小片段发夹RNA(shRNA)质粒对前列腺癌移植瘤的作用及其机制。方法构建AR shRNA并制备重组质粒。使用BALB/C裸鼠构建前列腺癌细胞DU-145移植瘤模型并分为模型对照组、阳性对照组和实验组(n=10)。阳性对照组、实验组和模型对照组裸鼠分别尾静脉注射氟尿嘧啶(20 mg/kg)、AR shRNA质粒(2 mg/kg)及等体积生理盐水共10 d,测定各组裸鼠的肿瘤体积生长情况,开始给药后第4周处死裸鼠剥离肿瘤,采用RT-PCT测定移植瘤中AR mRNA表达水平,采用Western印迹测定磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路相关蛋白表达水平。结果给药3 d时实验组和模型对照组裸鼠肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05),实验组裸鼠在给药后1 w、2 w、3 w和4 w时肿瘤体积较模型对照组显著降低(P<0.05)。实验组裸鼠移植瘤AR mRNA表达水平较模型对照组显著降低(P<0.05)。p-AKT、p-GSK3β和p-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达水平较模型对照组显著降低(P<0.05),AKT、GSK3β和mT OR蛋白表达较模型对照组显著升高(P<0.05)。结论 AR shRNA可抑制前列腺癌组织AR表达及PI3K/AKT信号通路相关蛋白磷酸化而发挥对前列腺癌移植瘤生长的抑制作用。

NLRP3炎性小体激活对VCI海马组织凋亡及自噬的影响研究

目的 探究NOD样受体蛋白3 (NLRP3)炎性小体激活对血管性认知功能障碍(VCI)海马组织凋亡及自噬的影响。方法 SPF级SD大鼠采用四血管阻断法复制VCI模型构建,根据研究目的分为正常对照组、假手术组、模型组、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)组。分别在造模前、造模后、给药后进行Morris水迷宫实验;同时取海马组织进行苏木精-伊红染色、TUNEL细胞凋亡、qRT-PCR检测磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B (Akt)、mTOR、NLRP3的表达水平、Western blot检测凋亡蛋白表达水平。结果 大鼠迷宫实验鉴定结果显示,造模后迷宫逃逸时间显著大于造模前,给药后模型组迷宫逃逸时间显著高于mTOR组和假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示,空白对照组无明显病变、假手术组稍有水肿,模型组海马组织局部有坏死灶,mTOR组仅有水肿。TUNEL染色结果显示,模型组海马组织中细胞凋亡相比其他组相对多,假手术组和mTOR组组织中细胞凋亡不明显,但各组间比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。qRT-PCR结果显示,模型组Akt、mTOR、NLRP3表达水平与正常对照组相比均有上升趋势,PI3K有降低趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测结果显示,p62、caspase-1、LC3-B、Bax蛋白在模型组与正常对照组、假手术组相比有上升趋势,与mTOR组相比有下降趋势;其中mTOR组LC3-B蛋白表达量与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NLRP3可能通过调控降低PI3K、升高Akt和mTOR水平促进海马神经元的凋亡而导致VCI的发生。

PI3K/Akt抑制剂LY294002对胃癌细胞化疗增敏作用的探讨

目的探讨PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002与化疗药物5-Fu及奥沙利铂联合使用对3种胃癌细胞系(MGC803、BGC823和SGC7901)化疗效果的影响。方法将PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002联合化疗药物5-Fu及奥沙利铂作用于3种胃癌细胞系,MTT法检测单独使用5-Fu、奥沙利铂及联合LY294002对体外培养的3种胃癌细胞系的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡。结果联合LY294002作用后,5-Fu、奥沙利铂对3种胃癌细胞系的增殖抑制作用明显增强(P<0.05),且凋亡率显著提高(P<0.05)。结论LY294002能有效提高化疗药物5-Fu、奥沙利铂体外对胃癌细胞的增殖抑制作用,抑制PI3K/Akt信号转导通路可显著提高胃癌的化疗疗效。

DIDS通过PI3-K/Akt途径减弱缺血/再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在DIDS(4,4′-diisothiocyanostilbene-2,2′-disulfonic acid)减弱缺血/再灌注损伤(I/RI)诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法以I/RI诱导心肌细胞凋亡,然后用PI3-K特异性的抑制剂LY294002[22(42吗啉基)282苯基24氢212苯并吡喃242酮]进行干预。实验分为正常对照组、I/RI组、I/RI+DIDS组和I/RI+DIDS+LY294002组。通过噻唑蓝(MTT)比色法、Hoechest-33258染色和半胱天冬蛋白酶(Apo-ONETMHomogeneous Caspase)-3试剂盒以及Western blot分别检测:心肌细胞的存活率(%)、细胞核的形态变化和caspase-3活性、Akt的磷酸化。结果①DIDS能够显著抑制I/RI诱导的细胞存活率的下降,抑制凋亡小体的出现,抑制caspase-3的活性的增加(P<0.01)。②用LY294002预处理后,DIDS保护I/RI心肌细胞存活的作用减弱、凋亡小体增加和caspase-3活性明显升高(P<0.01)。③I/RI组与正常对照组Akt磷酸化无明显差异,DIDS能够显著增加I/RI组中Akt蛋白的磷酸化(P<0.01)。用LY294002预处理后,DIDS对I/RI组Akt蛋白磷酸化的影响明显减弱(P<0.01)。结论DIDS可通过激活PI3-K/Akt信号通路减弱I/RI诱导的心肌细胞的凋亡。