p14^(ARF)基因抑制喉癌细胞生长及其对内源性p53表达的影响

目的 探讨p14ARF对喉癌细胞生长的抑制作用及其对内源性p5 3表达的影响 ,为喉癌致癌的分子机理和基因治疗提供理论基础。方法 采用基因转染技术 ,将全长野生型p14ARF 互补DNA(complementaryDNA ,cDNA)转染到人喉鳞状细胞癌Hep 2细胞中 ,利用流式细胞仪、聚合酶链反应(polymerasechainreaction ,PCR)和Western Blotting等方法研究其对细胞周期、内源性野生型p5 3表达的影响。结果 转染p14ARF基因的Hep 2细胞的生长受到明显抑制 ,其克隆形成能力为转染空载体的5 7%。细胞分析表明 ,转染p14ARFcDNA 48h后 ,处在G0 G1和G2 M期的细胞皆增加了 1倍。同时Western Blotting分析结果表明 ,内源性野生型p5 3表达明显上升。结论 p14ARF 基因能上调Hep 2细胞中内源性野生型p5 3的表达并阻滞细胞于G0 G1和G2 M期 ,从而抑制其生长。

非小细胞肺癌中p14^(ARF)基因的表达及意义

①目的检测p14ARF基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达情况,并探讨其在NSCLC发生、发展过程中的作用。②方法应用蛋白印迹方法检测了28例NSCLC组织标本p14ARF蛋白的表达水平。③结果肺鳞癌和肺腺癌中p14ARF蛋白阳性率分别为61.5%和80.0%,与癌旁正常组织(100%)比较差异有显著性(χ2=12.27、6.02,P<0.05);p14ARF表达异常与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移情况无显著相关性;p14ARF蛋白在Ⅰ期病例中强阳性占阳性比例为62.5%,在Ⅲ期病例中强阳性占阳性比例为16.0%。④结论p14ARF基因在NSCLC发生、发展过程中起重要作用,特别在肿瘤早期可能起更为重要的作用。

大肠癌组织p14^(ARF)与p53基因变异研究

目的:观察大肠癌组织p14ARF基因遗传和表观遗传变化及p53基因突变状况,探讨两者改变的关系及p14ARF-p53通路功能破坏在大肠癌发生中的作用。方法:应用PCR、直接测序、甲基化特异PCR和RT-PCR分别检测56例原发性大肠癌及相应癌旁正常组织p14ARF基因纯合性缺失、突变、5′CpG岛甲基化、mRNA表达及p53基因突变状况。结果:①大肠癌组织p14ARF总变异率为27%(15/56),其中1例纯合性缺失,14例5′CpG岛甲基化,未见突变发生。②15例p14ARF基因变异的大肠癌组织其相应mRNA表达阴性(13例)或低水平表达(2例),41例未发生基因变异的大肠癌组织和所有癌旁正常组织p14ARFmRNA均显示明显表达。③大肠癌组织p53突变率为48%(27/56)。④56例大肠癌组织中,12例仅发生p14ARF变异,24例仅显示p53突变,3例同时有p14ARF5′CpG岛甲基化和p53突变,17例p14ARF和p53均无变异,p14ARF-p53通路总变异率为70%(39/56),p14ARF5′CpG岛高甲基化与野生型p53状态有关(P<0·05)。⑤低分化腺癌组p14ARF变异率(44%,7/16)明显高于高中分化腺癌组(20%,8/40)(P<0·05),但两组间p53突变率无显著差异(P>0·05)。结论:①大肠癌p14ARF基因5′CpG岛高甲基化是其表达失活的主要机制;②大肠癌p14ARF基因高甲基化与p53基因突变可能是相互独立的事件,两者的失活可能各自出现于不同的大肠癌亚组中;③p14ARF高甲基化或p53突变引起的p14ARF-p53通路功能破坏在大肠癌的发生中具有重要作用。

p14^(ARF)、p53抑癌基因与胰腺癌发生、发展的相关研究

目的 :研究抑癌基因p14 ARF、p5 3在胰腺癌组织中的表达和胰腺癌细胞株PC 3转染p14 ARF基因前后的生长状况 ,探讨它们对胰腺癌发生、发展的影响。方法 :采用免疫组织化学法检测 10例正常胰腺组织、4 2例胰腺癌组织中p14 ARF蛋白、p5 3蛋白的表达。将外源性p14 ARFcDNA重组质粒pCI neo p14 ARF和空载体质粒pCI neo分别转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,观察转染后胰腺癌PC 3细胞株的生长状况。结果 :正常胰腺组织中p14 ARF的表达率为 90 % ,胰腺癌组织中为 35 .7% ;正常胰腺组织中p5 3的表达率为 0 ,胰腺癌组织中为 4 5 .2 %。胰腺癌PC 3细胞的p14 ARF基因呈缺失变异。外源性野生型p14 ARF基因和空载体质粒pCI neo成功转染入PC 3细胞 ,转染p14 ARF基因的胰腺癌细胞株第 1天生长抑制率为 2 2 % ,第 5天为 2 6 %。结论 :抑癌基因p14 ARF蛋白在胰腺癌中低表达 ,突变型p5 3蛋白在胰腺癌中呈高表达 ;转染p14 ARF基因的胰腺癌细胞株生长受到抑制 ;抑癌基因p14 ARF、p5 3对胰腺癌的发生、发展可能产生影响。

非小细胞肺癌中p14^(ARF)与p16^(INK4a)和p53蛋白表达及其相互关系的研究

目的:检测p14ARF、p16INK4a和p53蛋白在非小细胞肺癌中表达情况,对它们在非小细胞肺癌发生过程中的作用及其相互关系进行初步探讨。方法:应用免疫组化方法检测了40例非小细胞肺癌组织标本的p14ARF、p16INK4a和p53基因的表达水平。结果:非小细胞肺癌组织中p14ARF、p16INK4a和p53蛋白总阳性率分别是72.5%,50.0%和52.5%,与癌旁正常组织(分别是95.0%,92.5%,2.5%)有显著性差异(P<0.01);非小细胞肺癌中p14ARF和p53蛋白表达异常与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移情况无显著相关性;p16INK4a蛋白表达水平与组织分化程度相关(P<0.05),但与肿瘤分期、组织类型、淋巴结转移情况无关;p14ARF和p53蛋白在组织中表达呈负相关,r2=-0.475(P<0.01),而p14ARF和p16INK4a蛋白表达无关;p14ARF蛋白在Ⅰ期病例中强阳性(+++)占阳性比例为41.7%,在Ⅲ期中强阳性(+++)比例为10.0%。结论:p14ARF、p16INK4a和p53三个基因在NSCLC发生过程中起重要作用,特别在肿瘤早期可能起到更为重要的作用;p14ARF和p53基因在同一调节通路上;p14ARF、p16INK4a和p53蛋白可以作为非小细胞肺癌早期生物学检测指标。

p14^(ARF)基因通过p53途径对肝癌细胞的生长的影响

目的 探讨 p14 ARF对含有野生型 p5 3(wtp5 3)的肝癌细胞生长的影响及其作用机制。方法 将含p14 ARF的基因转染到人肝癌细胞HepG2中 ,通过流式细胞仪及生长曲线观察其对HepG2细胞周期及细胞生长的影响。利用Western Blotting方法及 p2 1waf1启动子荧光素酶活性检测p14 ARF对HepG2细胞 p5 3蛋白表达的影响。 结果 转染p14 ARF基因的HepG2细胞的生长速度从第 3天开始较空载体 pcDNA 3组减慢 ,处在G0 G1期细胞数 ( 70 .6 6 % )与空载体组 ( 6 1.5 5 % )相比明显增加 ,转染 pcDNA3p14 ARF( 1.0 92 3± 0 .0 370 ) p2 1waf1启动子荧光素酶活性较空载体组( 0 .76 73± 0 .0 180 )明显升高 ( P <0 .0 5 )。Westernblotting结果表明 ,p5 3表达也明显增加。 结论p14 ARF基因通过上调HepG2细胞的 p5 3表达导致 p2 1waf1的表达升高使细胞阻滞于G0 G1期 ,从而抑制细胞的生长。

p14^(ARF)基因改变及其蛋白表达与脑胶质瘤发生发展的相关性研究

一、材料与方法 脑胶质瘤石蜡包埋标本31例,包括Ⅰ、Ⅱ级星形细胞瘤8例,Ⅲ级间变性星形细胞瘤10例,Ⅳ级胶质母细胞瘤13例.另取5例脑挫裂伤组织作为正常对照.应用一种新型直接原位PCR方法检测p14^ARF基因外显子1β[引物（S）5＇-TCCCAGTCTGCAGTTAAGGG-3＇,（AS）5＇-ACCACGAAAACCCTCACTCC-3＇（扩增产物174bp）],并对该方法进行优化.采用SP免疫组化法检测p14^ARF蛋白.

应用5-氮杂胞苷对甲状腺乳头状癌细胞株P14^(ARF)基因启动子区去甲基化干预的研究

目的观察5-氮杂胞苷对PTC细胞株P14ARF基因甲基化状态的影响。方法用不同浓度梯度的5-氮杂胞苷培养PTC细胞株;分别采用实时定量PCR、Western-bloting检测不同浓度5-氮杂胞苷处理甲状腺乳头状癌细胞株后P14ARFm RNA及其蛋白的表达情况;采用甲基化特异性PCR检测不同浓度5-氮杂胞苷处理PTC细胞株后P14ARF基因的甲基化情况;采用CCK8法检测5-氮杂胞苷处理后的PTC细胞株的增殖情况。结果实时定量PCR检测随着5-氮杂胞苷浓度增加及处理时间的延长,PTC细胞株P14ARFm RNA表达水平逐步上调(P<0.05);P14ARF蛋白的表达升高(P<0.05);甲基化特异性PCR检测经5-氮杂胞苷处理后的PTC细胞株中P14ARF基因的甲基化情况下降,出现去甲基化(P<0.05);采用CCK8法检测经5-氮杂胞苷处理后的PTC细胞株增殖速度减慢(P<0.05)。结论 P14ARF在PTC是存在甲基化的,5-氮杂胞苷可以逆转P14ARF的甲基化状态,抑制PTC细胞株的增殖,发挥抗肿瘤作用,为临床靶向治疗甲状腺乳头状癌提供分子生物学的依据。