肺癌p14ARF和p16INK4a基因协同表达缺失及其意义

目的 :研究抑癌基因位点INK4a ARF在肺肿瘤细胞中的表达状况 ,揭示p14ARF和p16INK4a协同表达缺失与肺癌发生发展的相关性。方法 :用RT PCR和Westernblot对 6株肺癌细胞 (SPC A 1,Calu 1,H44 6 ,SH77,A5 49,H46 0 )的INK4a ARF基因位点在mRNA、蛋白质水平上进行检测 ,对PCR产物进行纯化和测序分析。结果 :6株肺癌细胞中 ,有 3株细胞 (H46 0 ,Calu 1,A5 49)的p16INK4a基因表达缺失 ,其中 ,Calu 1表达正常p14ARF的mRNA ,而在H46 0和H5 49这两株非小细胞肺癌中 ,p14ARF和p16INK4a发生协同表达缺失。结论 :p14ARF基因与p16INK4a一样 ,是肺肿瘤细胞中的失活靶点之一。揭示了p14ARF缺失导致p5

Fugene6——一种介导体外真核细胞高效率基因转染的新方法

目的建立一种介导体外真核细胞高效率基因转染的新方法。方法采用一种新的非脂质体基因转染试剂 Fu-gene 6 ,以人 p14ARF蛋白表达载体 (p CI- neo- p14ARF)为外源 DNA,转染存在 p14ARF基因原发缺失的人 H46 0 ,A5 49,U2 5 1和 PC- 3共 4个癌细胞系 ,通过 G418筛选 2 1d确定转染效率。结果经转染的 4个细胞系培养孔中均长出了抗 G418细胞克隆 ,而且这些细胞克隆的 p14ARF基因 PCR产物均为阳性 ,细胞毒性分析发现高浓度 Fugene6作用下各细胞的增殖活力未受影响。结论 Fugene 6为一简便快速、易操作。

p14ARF基因联合氟尿嘧啶对人结肠癌LOVO细胞的作用

目的观察p14ARF基因转染联合氟尿嘧啶对人结肠癌LOVO细胞的作用。方法采用RT-PCR和Western blot方法检测转染前后LOVO细胞中p14ARF基因的表达。四唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,对比在不同浓度的氟尿嘧啶作用下转染前后LOVO细胞的增殖情况。结果LOVO细胞呈现p14ARF基因缺失变异。RT-PCR和Western blot法证实转染后LOVO细胞中有p14ARF基因的表达。p14ARF基因转染后细胞增殖受抑,流式细胞仪显示p14ARF基因诱发凋亡。在氟尿嘧啶0.1g/mL的作用下,未转染的LOVO细胞的增殖速度未受影响,而转染后LOVO细胞较未用药时的抑制率增加;氟尿嘧啶1、10、100μg/mL时,对转染前后LOVO细胞均有增殖抑制作用,且呈剂量相关性。氟尿嘧啶对转染后LOVO细胞的抑制率明显高于未转染的LOVO细胞。结论p14ARF基因转染可抑制LOVO细胞增殖。p14ARF基因和氟尿嘧啶联合用于LOVO细胞能够加强氟尿嘧啶的增殖抑制作用,明显提高LOVO细胞对氟尿嘧啶的敏感性。

p14ARF蛋白在人脑胶质瘤中的缺失及其临床意义

目的 研究人脑胶质瘤中p14ARF蛋白的缺失情况及其与临床病理的关系。方法 采用链霉菌素 生物素 (SP)免疫组织化学法对 5 5例脑胶质瘤标本进行分析。结果 在 5 5例人脑胶质瘤标本中p14ARF缺失率为 5 0 .9%。I级 II级病例p14ARF缺失率为 32 % ,III级 IV级病例p14ARF缺失率为 6 6 .7% (P <0 .0 5 )。结论 p14ARF蛋白缺失与脑胶质瘤的发生发展有一定的相关性 ,提示p14ARF基因的失活可能是脑胶质瘤恶性演变的重要因素。

外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的 :研究P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞株 (U 2 5 1)生长的影响。方法 :用脂质体介导携带P14ARF的真核表达载体转染U 2 5 1细胞 ,观察其对该细胞株的生长、增殖周期等生物学行为的影响。结果 :导入P14ARF基因能使人脑胶质瘤U 2 5 1细胞生长速度明显减慢 ,细胞周期阻滞于G1期。裸鼠致瘤减缓。结论 :P14ARF对人脑胶质瘤细胞U 2 5

野生型p14ARF基因转染对人肺癌细胞生长抑制的实验研究

目的 探讨外源性p14ARF基因能否对体内外生长的肺癌细胞起抑制增殖的作用。方法 选择 4株具有不同基因背景的肺癌细胞系 ,转染人的野生型p14ARF基因。通过RT PCR、免疫组化及Westernblot杂交检测 ,筛选出同时表达p14ARFmRNA及蛋白的阳性克隆。以母细胞及转染空载体细胞为对照 ,比较它们的增殖、细胞周期分布、裸鼠体内成瘤性以及形态学上的差异。结果 三株具有野生型p5 3基因的肺癌细胞在转染p14ARF基因后 ,细胞周期被显著阻滞于G1或G1/G2期 ,增殖受到抑制。结论 外源性野生型p14ARF基因转染能抑制人肺癌细胞的增殖 ,p14ARF基因是人肺癌基因治疗的理想候选基因。

非小细胞肺癌中p14^(ARF)与p16^(INK4a)和p53蛋白表达及其相互关系的研究

目的:检测p14ARF、p16INK4a和p53蛋白在非小细胞肺癌中表达情况,对它们在非小细胞肺癌发生过程中的作用及其相互关系进行初步探讨。方法:应用免疫组化方法检测了40例非小细胞肺癌组织标本的p14ARF、p16INK4a和p53基因的表达水平。结果:非小细胞肺癌组织中p14ARF、p16INK4a和p53蛋白总阳性率分别是72.5%,50.0%和52.5%,与癌旁正常组织(分别是95.0%,92.5%,2.5%)有显著性差异(P<0.01);非小细胞肺癌中p14ARF和p53蛋白表达异常与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移情况无显著相关性;p16INK4a蛋白表达水平与组织分化程度相关(P<0.05),但与肿瘤分期、组织类型、淋巴结转移情况无关;p14ARF和p53蛋白在组织中表达呈负相关,r2=-0.475(P<0.01),而p14ARF和p16INK4a蛋白表达无关;p14ARF蛋白在Ⅰ期病例中强阳性(+++)占阳性比例为41.7%,在Ⅲ期中强阳性(+++)比例为10.0%。结论:p14ARF、p16INK4a和p53三个基因在NSCLC发生过程中起重要作用,特别在肿瘤早期可能起到更为重要的作用;p14ARF和p53基因在同一调节通路上;p14ARF、p16INK4a和p53蛋白可以作为非小细胞肺癌早期生物学检测指标。

幽门螺旋杆菌和p14^(ARF)在蒙古族、汉族胃癌患者癌组织中的表达变化及意义

目的探讨幽门螺旋杆菌(Hp)和抑癌基因p14^(ARF)在蒙古族、汉族胃癌患者癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达变化及意义。方法采用免疫组化SP法、改良的Warthin-Starry(W-S)银染色法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测Hp和p14^(ARF)在27例蒙古族胃癌患者和30例汉族胃癌患者癌组织、癌旁组织和正常组织中蛋白和mRNA表达。Spearman相关性分析汉族、蒙古族胃癌患者癌组织中Hp与p14^(ARF)表达的关系。结果p14^(ARF)在蒙古族、汉族胃癌患者癌组织中的表达低于癌旁组织和正常组织,差异有统计学意义(P均<0.05),癌旁组织低于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05),p14^(ARF)在蒙古族、汉族人群各组织中的表达差异无统计学意义(P均>0.05)。蒙古族、汉族胃癌患者癌组织中Hp阳性率较高,两民族感染率比较差异无统计学意义(P>0.05)。汉族胃癌患者p14^(ARF)mRNA相对表达量在癌、癌旁、正常组织中两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。蒙古族胃癌患者p14^(ARF)mRNA相对表达量在癌、癌旁、正常组织中两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。蒙古族、汉族胃癌患者p14^(ARF)mRNA相对表达量在癌、癌旁和正常组织中差异无统计学意义(P均>0.05)。Spearman相关性分析显示,汉族、蒙古族胃癌患者癌组织中Hp与p14^(ARF)阳性表达呈负相关(r分别为-0.406、-0.433,P均<0.05)。结论蒙古族、汉族胃癌患者癌组织中p14^(ARF)均呈低表达,Hp阳性率均较高,Hp阳性与p14^(ARF)表达呈负相关关系;Hp与p14^(ARF)在蒙古族、汉族胃癌中的发病机制可能相同,二者可能共同促进胃癌的发生。

甲状腺乳头状癌中P14^(ARF)基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义

目的探讨甲状腺乳头状癌中P14ARF基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义。方法应用QRT-PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、免疫组织化学SP法分别检测人甲状腺乳头状癌及正常甲状腺组织标本中P14ARF基因及其蛋白的表达情况和P14ARF的甲基化状况并对比研究其生物学意义。结果 QRT-PCR检测显示甲状腺乳头状癌组织中P14ARFmRNA的表达明显低于对照组;免疫组织化学结果显示P14ARF蛋白在甲状腺乳头状癌中低表达;MSP检测结果示P14ARF启动子在甲状腺乳头状癌中过度甲基化。P14ARF及其蛋白的表达在甲状腺乳头状癌和对照组之间有统计学显著差异(P<0.05)。结论在甲状腺乳头状癌组织中P14ARF基因及其蛋白均呈现低表达,提示P14ARF基因在甲状腺乳头状癌发生发展中起抑癌作用,其低表达和P14ARF基因的过度甲基化有关。

p53基因网络的研究进展

肿瘤抑制基因p53与其上、下游功能相关基因组成了一个复杂的基因网络。p53基因位于人染色体17q13.1区带,编码的野生型p53蛋白包含N-末端的转录激活结构域、DNA结合结构域、四聚体化结构域和C-末端调节域。p73、p51、p63等基因由于在结构上与p53基因具有同源性,因而被归为p53基因家族。p53是联系不同遗传应急和细胞应答的中间环节,离子辐射、化疗药物及异常的细胞生长信号均能刺激p53基因表达。p53表达升高后,可通过p53-mdm2、p14ARF-mdm2环路对p53表达水平进行精确调节,p53功能的发挥还同时需要p33ING1b基因的协同作用。磷酸化和乙酰化是细胞内调节p53活性功能的主要途径。p53可以调控下游多种基因表达,其功能主要表现在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定性和抑制肿瘤血管生成四个方面。认识p53基因网络的功能将有助于理解p53及其相关基因间的具体作用机制。

抑癌基因p14^(ARF)对慢性粒细胞白血病细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响机制研究

目的探讨抑癌基因p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞的增殖、细胞周期及凋亡的的影响机制研究。方法应用慢病毒载体系统,将抑癌基因p14ARF导入慢性粒细胞白血病细胞系及患者来源的慢性粒细胞白血病细胞中,应用WST-8法检测细胞生长存活率,应用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果应用表达p14ARF的VSV-G假构型慢病毒载体可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖,诱导细胞凋亡,但对细胞周期没有明显的影响。结论利用p14ARF基因治疗可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞的增殖。

胰腺癌PC-3细胞株外源性p14ARF抑癌基因表达与内源性p53表达水平的关系

目的 探讨外源性 p1 4ARF基因表达于胰腺癌PC 3细胞后与另一重要细胞周期调控蛋白 p53表达水平的相互关系。 方法 将含人 p1 4ARFcDNA的重组质粒通过脂质体介导转染入胰腺癌PC 3细胞中 ,并筛选出阳性克隆 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblot法检测PC 3细胞转染前后p1 4ARF的mRNA及蛋白的表达 ,同时用Westernblot分析其内源性 p53蛋白表达水平的变化。噻唑蓝 (MTT)比色法测定PC 3细胞在转染前、后的生长曲线变化。结果 胰腺癌PC 3细胞中p1 4ARF基因缺失。外源性 p1 4ARF基因成功转染入PC 3细胞并获得 1 4× 1 0 3大小的p1 4蛋白表达 ,且内源性 p53蛋白表达水平在转染后明显增高。PC 3细胞在导入 p1 4ARF基因后第 1天及第 5天的生长抑制率分别为 2 2 %及 2 6 % ,两者差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论 p1 4ARF基因可上调胰腺癌PC 3细胞的内源性p53蛋白表达水平 ,从而发挥其细胞周期阻滞功能。

原发性肝癌p14ARF基因CpG岛甲基化研究

目的探讨p14ARF基因启动子区CpG岛甲基化与原发性肝细胞肝癌发生、发展的关系。方法采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测42例原发性肝癌组织及癌旁组织中p14ARFmRNA的表达,同时用甲基化特异PCR（methylation-specific PCR,MSP）方法分析p14ARF基因启动子区域甲基化状况。结果42例肝癌组织有7例呈p14 mRNA的表达,表达率17%。癌旁正常组织均有p14表达。p14mRNA在原发性肝癌组织中明显表达缺失（χ^2=56.62,P〈0.05）;42例原发性肝癌组织中,有19例检测到p14基因启动子的甲基化,甲基化发生率45%。相应癌旁组织未发现甲基化。p14ARF基因在原发性肝癌呈现明显高甲基化（χ^2=22.04,P〈0.05）。在p14mRNA表达的7例肝癌组织中没有检测到p14基因启动子的甲基化,而在p14mRNA表达缺失的35例肝癌组织中。19例p14基因启动子呈现甲基化。肝癌组织中p14ARF基因启动子甲基化与p14mRNA表达缺失明显相关（χ^2=4.66,P〈0.05）。结论在原发性肝癌p14 mRNA明显表达缺失,原发性肝癌p14ARF基因启动子频繁甲基化可能是p14ARF失活的原因之一。

燃煤污染型地方性砷中毒患者皮肤组织P14ARF和MDM2及突变型P53蛋白表达

目的 观察燃煤污染型地方性砷中毒患者皮肤组织突变型P53（ P53mt）蛋白及其下游基因P14ARG、MDM2蛋白的表达水平,为揭示砷致皮肤损害的分子机制提供依据.方法 以自愿手术治疗的60例燃煤污染型地方性砷中毒患者作为观察对象,依据皮肤病理学诊断分为一般皮肤病变组（35例）、癌前病变组（19例）、癌变组（6例）；以某医院经病理学诊断无异常的非肿瘤手术患者的9例皮肤组织为对照,采用免疫组织化学EnVision二步法检测皮肤组织中P14ARF、MDM2和P53mt蛋白的表达情况.结果 4组皮肤组织P14ARF蛋白表达阳性率比较,差异有统计学意义（x2=9.39,P＜0.05）；其中癌前病变组、癌变组[46.1％（6/19）、33.3％（2/6）]明显低于对照组[88.9％（8/9）,P均＜0.05]；且随着皮肤病变程度的加重,P14ARF蛋白表达呈降低趋势（P＜0.05）.4组皮肤组织MDM2、P53mt蛋白表达阳性率比较,差异有统计学意义（x2值分别为6.21、20.64,P均＜ 0.05）；其中一般病变组、癌前病变组和癌变组[54.2％（ 19/35）、63.2％（10/19）、66.7％（4/6）和25.7％（9/35）、73.7％（14/19）、83.3％（5/6）]明显高于对照组（0、0,P均＜0.05）；随着皮肤病变程度的加重,MDM2和P53mt蛋白表达呈增强趋势（P均＜0.05）.结论 燃煤污染型地方性砷中毒患者皮肤组织P53mt蛋白表达阳性率升高,且P14ARF和MDM2蛋白表达异常,后者所致的细胞周期和凋亡调控失常可能是砷致皮肤病损发生发展的原因之一.

膀胱移行细胞癌和p14ARF基因

目的探讨p14ARF在膀胱癌中的表达及其与膀胱移行细胞癌发生的关系。方法用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测162例膀胱移行细胞癌和20例癌旁正常组织中p14ARF基因mRNA表达情况。结果p14ARF基因mRNA在膀胱癌中的阳性表达率为33．9％（21／62），在癌旁正常组织中的阳性表达率为100％（20／20），两者相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论p14ARF基因mRNA在膀胱癌中的失表达可能与膀胱癌的发生有关。

姜黄素对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的去甲基化作用研究

目的观察姜黄素作用于皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞后E-cadherin和p14ARF基因甲基化状态及基因表达的改变情况,为姜黄素的临床应用提供理论依据。方法用不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的姜黄素处理皮肤鳞癌细胞株SCL-1,MTT法检测细胞增殖情况,甲基化特异性PCR(MSP)法检测E-cadherin和p14ARF基因甲基化状态的改变,RT-PCR法检测E-cadherin和p14ARF基因的表达情况。结果姜黄素可抑制SCL-1细胞的增殖,且呈现时间-剂量依懒性;当姜黄素浓度增至40μmol/L时,SCL-1细胞的E-cadherin和p14ARF基因甲基化减弱、表达增强。结论姜黄素可明显抑制SCL-1细胞增殖,适当浓度的姜黄素对SCL-1细胞的E-cadherin和p14ARF基因有一定的去甲基化作用,并可以调控E-cadherin和p14ARF基因的表达。

P14^(ARF)相关信号通路

p14ARF是新近发现的一种具有细胞周期调节功能的抑癌基因,P14ARF主要定位于核仁,但也有少部分位于核质。p14ARF在部分人类肿瘤中频发失活,其表达异常导致肿瘤的发生机制及以P14ARF为靶点进行的肿瘤治疗越来越受到重视。现对于Pl4ARF相关信号通路的研究进展进行了综述。