DELETIONS AND POINT MUTATIONS OF p16,p15 GENE IN PRIMARY TUMORS AND TUMOR CELL LINES

INTRODUCTION Cytogeneticandmoleculargeneticanalyseshaverevealedthatchromosome9p2122isinvolvedinthegenesisandorprogressionofmanydifferenttypesoftumors.Thechromosomalalterationsat9p2122,includinginversions,translocations,rearrangements,heterozygousa...

PHI调控Molt-4细胞组蛋白甲基化诱导p15基因去甲基化后再表达

本研究探讨异硫氰酸苯己酯(PHI)对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞组蛋白H3K4、H3K9甲基化,及p15基因的去甲基化的调控作用及诱导沉默基因重新表达的机制。用Western blot方法检测PHI作用后Molt-4细胞的组蛋白H3K4、H3K9甲基化状态及P15蛋白的表达的变化;应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Molt-4细胞经过PHI处理后p15基因的mRNA的表达变化。结果表明,PHI作用于Molt-4细胞可增强组蛋白H3K4甲基化表达,抑制组蛋白H3K9甲基化表达,并呈浓度及时间依赖性;PHI作用于Molt-4细胞5天后,p15基因的甲基化程度减弱,p15基因的异常高甲基化现象被逆转,沉默的p15基因重新表达;p15 mRNA、P15蛋白表达增加,并呈浓度依赖性。结论:PHI可能通过特异性调节组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平,引起染色体空间结构发生变化,使p15基因的CPG岛去甲基化,从而诱导p15基因重新表达。

人原发性肝癌中p16,p15基因CpG岛甲基化研究

目的 检测人原发性肝癌中 p16和 p15基因 5’启动子区CpG岛的异常甲基化 ,并分析其与人原发性肝癌发生发展的关系 ,探索其在临床早期基因诊断和治疗中的意义 .方法 用敏感的甲基化特异性PCR检测 2 0例人原发性肝癌患者癌组织、癌旁组织和远癌正常组织中p16 ,p15基因5’CpG岛的甲基化状况 ,统计分析这两个基因 5’CpG岛甲基化与肝癌病理特征的相关性 .结果 2 0例原发性肝癌肝癌组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 5 %(13/2 0 )和 5 0 %(10 /2 0 )异常甲基化 ;癌旁组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 0 %(12例 )和 4 0 %(8例 )异常甲基化 ;远癌正常组织中p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 35 %(7例 )和 2 5 %(5例 )异常甲基化 .p16 ,p15基因 5’CpG岛甲基化在癌组织和癌组织旁、癌组织和远癌组织中均有相关性 .两个基因 5’CpG岛异常甲基化与临床病理特征无显著相关性 .结论 p16和 p15基因 5’CpG岛异常甲基化在人原发性肝癌中频率很高 ,可能在肝癌发生发展中扮演了重要角色 ;而且这可能是一个早期事件 ,其临床早期诊断和基因治疗意义均值得进一步深入研究 .

喉癌中p15、p16基因纯合缺失与EGFR基因扩增相关性研究

研究p15、p16基因缺失和EGFR基因扩增的相关性及其与喉癌发生、发展的关系。提取喉癌新鲜组织中基因组DNA ,采用聚合酶链反应技术 ,分别对 3 0例喉癌进行p15基因第 2外显子 (p15E2 )和p16基因第 2外显子(p16E2 )进行纯合缺失研究 ;应用FISH方法进行喉癌实体瘤EGFR基因扩增研究。p15E2纯合缺失率为 13 3 % (4 3 0 ) ,p16E2纯合缺失率为 16 7% (5 3 0 ) ,p15E2、p16E2共同缺失率为 6 7% (2 3 0 )。在 3 0例喉癌实体瘤EGFR基因扩增频率为 3 0 % (9 3 0 ) ,扩增 2～ 8倍。p15E2和p16E2纯合缺失以及二者共同缺失与EGFR基因扩增相关 ,可能引起细胞周期失控而导致细胞增殖紊乱 。

巢式PCR法检测肝母细胞瘤中p15和p16基因启动子异常甲基化

目的DNA甲基化被认为是反映细胞内DNA转录状态的重要遗传学标记。该研究旨在对小儿肝母细胞瘤中p15和p16基因5′启动子区CpG岛异常甲基化的相关性进行评估,并分析其与小儿肝母细胞瘤发生发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR法,对30例小儿肝母细胞瘤、癌旁和远癌正常组织进行巢式PCR扩增,经凝胶电泳和测序方法检测目的片段。结果30例小儿肝母细胞瘤组织中p15和p16基因5′CpG岛有30%(9/30)和67%(20/30)、癌旁组织中有20%(6/30)和57%(17/30)、远癌正常组织有13%(4/30)和33%(10/30)异常甲基化。在肝母细胞瘤中发现1例p15E2纯合缺失,缺失率为3%(1/30),E1和部分I1区域未见缺失;p16E2和部分I2区域中3例杂合缺失,缺失率为10%(3/30),E1和部分I1区域未见缺失。结论p15和p16基因5′启动子区CpG岛的异常甲基化可能在肝母细胞瘤发生发展中扮演了重要角色,其主要机制可能是启动子区CpG岛甲基化抑制了基因的转录。

骨髓增生异常综合征P15^(INK4B)基因甲基化及药物去甲基化作用

目的检测骨髓增生异常综合征(M DS)患者P 15INK 4B基因甲基化状况;探讨5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶(dec itab ine)和三氧化二砷(A s2O3)对M DS患者细胞的去甲基化作用。方法采用限制性内切酶联合PCR方法检测14例M DS患者P 15INK 4B基因甲基化,选择1例由M DS转化为急性白血病患者的外周血单个核细胞,分组分别加入dec itab ine和A s2O3进行处理,分析甲基化程度变化情况。结果低危组M DS患者(RCM D)均未发现P 15INK 4B基因甲基化,4例高危组M DS患者(RAEB)和4例M DS-AL患者发现P 15INK 4B基因甲基化。经dec itab ine和A s2O3处理后,M DS患者细胞的甲基化程度均降低50%左右。结论M DS的发生与P 15INK 4B基因甲基化密切相关,dec itab ine和A s2O3均对M DS患者细胞高度甲基化的P 15INK 4B基因具明显去甲基化作用。

p16和p15及PCNA在子宫颈癌组织中的表达及临床病理意义

目的:研究p16、p15蛋白及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在子宫颈癌中的表达特点,并探讨其与病理分级的关系。方法:应用免疫组织化学ElivisionTM二步法检测41例宫颈癌及30例正常宫颈组织中p16、p15及PCNA的表达情况,并结合病理分级进行分析。结果:1)p16和p15蛋白在宫颈癌组织的表达率分别为14·63%(6/41)和17·07%(7/41),明显低于在正常宫颈组织中的表达率100%(30/30)和96·67%(29/30),χ2=8·834,P=0·003;2)p16、p15蛋白阳性表达率与宫颈癌组织的病理学分级有关,p16、p15在宫颈癌Ⅰ级中的阳性表达率28·57%(4/14)、28·57%(4/14),明显高于Ⅱ级18·75%(3/16)、12·50%(2/16),χ2=6·069,P=0·014,也高于Ⅲ级9·09%(1/11)、9·09%(1/11),χ2=7·86,P=0·005;3)宫颈癌组织PCNA阳性表达率95·12%(39/41)及阳性细胞指数(47·97±8·69)%,均明显高于正常对照组的阳性表达率3·33%(1/30)及阳性细胞指数(3·56±0·53)%,χ2=10·773,P=0·001;并且与病理学分级存在相关性。结论:抑癌基因p16、p15的表达缺失在子宫颈癌中同时存在,p16、p15及PCNA检测对于研究宫颈癌的发生、发展和评估子宫颈癌恶性程度具有重要意义。

p15 mRNA在肺癌组织中的表达及其意义

目的 研究抑癌基因 p15 m RNA在肺癌组织中的表达 ,揭示 p15基因的失活与肺癌的发生和其组织类型的相关性 .方法 对病理确诊的 93(非小细胞肺癌 6 5 ,小细胞肺癌2 8)例肺癌病理组织切片 ,采用 p15 c DNA探针以原位杂交组织化学方法检测 p15 m RNA在肺癌组织中的表达水平 .结果 p15 m RNA阳性表达于肺癌组织细胞质或细胞核中 ,在细胞质中可见到较多的棕黄色颗粒 ,而细胞核内棕黄色颗粒相对少见 . p15 m RNA的阳性表达率 :非小细胞肺癌为 4 6 %(30 /6 5 ) ,其中鳞癌 4 6 % (2 3/5 0 ) ,腺癌 4 7% (7/15 ) .小细胞肺癌 2 0 % (5 /2 5 ) .非小细胞肺癌 p15 m RNA阳性表达率高于小细胞肺癌 ;高分化的鳞、腺癌阳性表达率高于同组中的低分化的鳞、腺癌 (P<0 .0 5 ) .结论 p15基因的失活与肺癌的发生密切相关 。

p15^(INK4B)基因转染对人食管鳞癌细胞EC109增殖的抑制作用

目的:探讨p15INK4B(p15)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组:p15转染组,空载体转染组,未转染组.应用PCR检测外源性p15基因,Westernblot方法检测转染细胞的P15蛋白变化:流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p15基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p15转染细胞存在外源p15基因,并有P15蛋白高表达;EC109-p15细胞生长速度低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组,集落形成率显著低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组(20.8±1.3%vs54.3±3.2%,56.8±2.3%,P<0.01);流式细胞仪观察到P15蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(62.4±7.1%vs38.0±5.8%,34.4±1.0%,P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(21.1±1.3%vs35.5±2.4%,36.3±0.7%,P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p15转染组发生细胞凋亡.结论:p15基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.

p15^(INK4B)基因甲基化在急性粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病中的研究

为探索 p15 INK4B基因在CpG岛高甲基化对白血病发病机制的重要作用 ,应用敏感的甲基化特异的MSP PCR的测定方法 ,测定了 p15 INK4B基因在急性粒细胞白血病 (AML)和慢性粒细胞白血病 (CML)中甲基化的表达变化。研究结果表明 ,p15 INK4B基因操纵区在AML和CML中的甲基化发生率分别为 83.9% (2 6/ 31)和 0 % (0 / 2 8)。结论提示 :甲基化是p15 INK4B基因在AML中主要的失活方式之一 ,并可在病程进展中出现甲基化 ,使病情加重 ;在CML中无甲基化的发生 ,说明p15

TGF-β_1、p15在食管鳞癌中的表达及其生物学意义

目的探讨转化生长因子1β(TGF-1β)、p15基因及其蛋白在食管鳞癌中的表达与食管鳞癌发生的关系。方法采用免疫组化SP法和原位杂交技术检测48例食管鳞癌组织,18例癌旁不典型增生组织和10例切缘正常组织中TGF-1β与p15 mRNA及其蛋白的表达。结果食管鳞癌组织中TGF-1β的阳性表达率(62.5%)低于正常组织(100%),P<0.05;食管鳞癌组织中p15 mRNA和p15蛋白的阳性表达率分别为56.3%和47.9%,二者表达明显相关(χ2=22,P<0.05),均低于在正常组织和不典型增生组织中的表达(P<0.05);食管鳞癌组织中TGF-1β的表达与p15 mRNA的表达明显相关(χ2=23.84,P<0.05)。结论食管鳞癌组织中TGF-1β对p15基因及其蛋白的转录可能有正向调节作用;TGF-1β、p15基因及其蛋白的低表达可能与食管鳞癌的发生有关。

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的p16^(INK4a)及p15^(INK4b)基因突变

目的 了解环磷酰胺 (CP)和塞替哌 (TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)的恶性转化株内BEAS CP和BEAS TE细胞p16和p15基因的突变情况。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)、聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)及DNA序列分析技术。结果 BEAS CP细胞p15基因的外显子 1和外显子 2都出现了异常带型。BEAS TE细胞p16基因的外显子 1及外显子 2a出现了异常带型和迁移率滞后现象 ;p15基因外显子 1的 2条单链带之间出现异常条带。DNA序列分析发现BEAS CP细胞的p15基因外显子 1的 182位有C的插入 ,2 0 6位有G的插入 ;外显子 2的第 30 8位密码子有C→T(TCC→TTC)转换 (Ser→Phe) ,第 32 7位密码子有T→A(AAT→AAA)颠换 (Asn→Lys)。BEAS TE细胞的p16基因外显子 2a的第 12 5位密码子有G→A(CGC→CAC)转换 (Arg→His)。结论 p15基因在CP诱导BEAS 2B发生恶性转化的过程中发挥了重要作用。在TEPA诱导BEAS 2B细胞发生恶性转化的过程中可能涉及了p16基因的失活。

中国人脑瘤中p16、p15基因缺失分析

目的 为了解 p16、p15基因与中国人脑肿瘤遗传易感性的关系。 方法 应用PCR、银染PCR SSCP及免疫组化法对 88例脑肿瘤及相应手术切除正常组织DNA标本 p16、p15基因进行研究。 结果 结果显示在不同病理分级脑胶质瘤中p16、p15基因缺失率分别为Ⅰ -Ⅱ级 4%、0 % ,Ⅲ级 3 2 %、2 8% ,Ⅳ级 3 6 %、2 7% ,p16、p15基因缺失主要见于Ⅲ -Ⅳ级肿瘤中 ;脑转移瘤中也检出缺失该基因 ( 2 /3 ) ,而原发性非胶质细胞瘤 (脑膜瘤、垂体瘤、听神经瘤等 )中未见p16、p15基因缺失 ,各类肿瘤标本PCR SSCP分析均未见 p16、p15基因点突变。 结论 表明国人脑瘤中p16、p15基因异常以缺失为主 ,p16、p15基因缺失在脑胶质瘤中发生频率较高 ,促进肿瘤细胞由良性向恶性演进 ,而对良性非胶质细胞瘤的发病没有作用。

p16和p15基因在子宫内膜癌中的表达

目的 :探讨抑癌基因 p16及 p15在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生及正常子宫内膜组织中的表达及其与子宫内膜癌的关系。方法 :应用免疫组化技术检测 5 7例子宫内膜癌、 8例子宫内膜不典型增生、 7例子宫内膜增生过长及 7例正常增生期子宫内膜组织中抑癌基因 p16、p15的表达。结果 :p16在子宫内膜癌组织及非癌子宫内膜组织中表达率分别为 4 0 .4 %和 77.3% ,二者表达率差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,在子宫内膜癌中 p16表达与病理类型、病理分级及手术 -病理分期有关 ,与肌层浸润无关 ;p15在子宫内膜癌及非癌子宫内膜组织中表达率分别为 4 7.4 %和 86 .3% ,二者比较差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,在子宫内膜癌组织中 p15的表达与病理分级有关 ,与病理类型、肌层浸润及手术 -病理分期无关 ,子宫内膜癌组织中 p16与 p15表达呈正相关 (r=0 .91,P<0 .0 5 )。结论 :p16和 p15表达缺失在子宫内膜癌的发生发展过程中发挥一定作用 ,其中以 p16更为显著 ;p16和 p15的表达具有一致性 ,功能上有一定的互补作用。

亚砷酸诱导人食管癌细胞株EC109细胞p15^(INK4B)基因的表达

目的：研究亚砷酸(As_2O_3)对人食管癌EC109细胞株细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15^(INK4B)(p15)基因表达的影响．方法：终浓度2μmol/L的As_2O_3加入食管癌EC109细胞系,采用甲基化特异PCR(MSP)检测食管癌EC109细胞系中p15基因甲基化,采用RT-PCR和Western blot方法检测As_2O_3处理前后p15的mRNA和蛋白质水平的表达情况．用Scion Image软件测量条带灰度值,P15蛋白与ACTB条带的灰度比进行半定量分析．结果：EC109细胞p15基因发生高甲基化,p15基因不表达．As_2O_3作用后p15基因甲基化程度明显下降,As_2O_3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(37．11±3．62,50．92±5．47,72．07±7．53 vs 97．23±9．80,P＜0．05)．As_2O_3作用24 h后出现p15 mRNA表达,随As_2O_3作用时间延p15 mRNA表达逐渐增强,各个时间组之间比较,除了未加药组和加药24 h组之间及加药24 h组和加药48 h组之间差异无统计学意义外,其余各个时间组之间差异有统计学意义(0．72±0．07 vs 0．58±0．06 vs 0．48±0．07 vs 0．41±0．08,P＜0．05)．As_2O_3作用24 h后P15蛋白出现表达,2μmol/L作用24-72 h中P15蛋白条带灰度逐渐增强,As_2O_3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(0．51±0．02 vs 0．21±0．01 vs 0．16±0．02 vs 0．06±0．01,P＜0．05),说明其表达随As_2O_3作用时间延长而逐渐增强．结论：As_2O_3可使食管癌EC109细胞p15基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制细胞周期进程．

肺癌组织中p53、K-ras、p15、p16基因的改变

目的 探讨p5 3、K ras、p15、p16基因在肺癌组织中改变情况及多基因联合检测在肺癌诊断中的价值。 方法 对 5 9例肺癌组织和 14例肺部良性组织 ,应用PCR SSCP 银染法检测 p5 3基因第 5～ 8外显子突变情况 ;应用PCR RFLP法对K ras基因突变进行检测 ;并应用PCR法检测 p15、p16基因纯合缺失情况。 结果 肺癌组织中 p5 3、p15、p16基因改变频率分别为 3 7.3 %、11.9%、2 3 .8% ,而在肺部良性组织中只有 1例 p16基因阳性。在 2 5例肺腺癌中 ,K ras基因突变率为 48.0 % ,其它类型肺癌中突变率仅为 8.8% ,而 14例良性组织中未检测出K ras基因突变。另外 ,p5 3基因和K ras基因突变与吸烟存在着密切关系 ,即吸烟者出现突变的频率 ( 4 8.7% ,68.5 % )明显高于非吸烟者 ( 15 .0 % ,11.1% ) ,P <0 .0 1。 4种基因联合检测敏感度为 78.0 % ,明显高于单一基因 (以阳性率最高的 p5 3为例 )的敏感度 3 7.3 %。 结论 p5 3基因、K ras基因和 p16基因在肺癌组织中改变率相对较高 ;多基因的联合检测有助于肺癌的早期诊断和筛查。

多发性骨髓瘤p15、p16基因启动子区甲基化的研究

目的 探讨 ｐ１５、ｐ１６基因启动子区 ＣＰＧ岛甲基化在多发性骨髓瘤发病中的作用。方 法 利用甲基化特异性 ＰＣＲ技术，研究骨髓瘤细胞株（Ｕ２６６、ＬＰ１、ＫＭ３）及多发性骨髓瘤患者 ｐ１５、ｐ１６基因甲基化状态。结果 Ｕ２６６、ＬＰ１细胞 ｐ１５、ｐ１６基因处于完全甲基化状态；ＫＭ３细胞 则为完全未甲基化模式；ＭＭ患者的ｐ１５、ｐ１６基因启动子区甲基化比例分别为 ５２．３８％及 ５７．１４％。 ｐ１５、ｐ１６基因甲基化与 ＭＭ分期无关（Ｐ＞０．０５）。结论 ｐ１５、ｐ１６基因甲基化在多发性骨髓瘤中 较为常见，这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供借鉴。

乙酸镍诱导16HBE细胞恶变过程中的K-ras和P15基因的改变及基因组不稳定性分析

目的 :检测乙酸镍对 K- ras基因和 P15基因的改变及基因组不稳定性的影响 ,从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 :采用聚合酶链反应 -单链构象多态性分析方法探查乙酸镍在诱导 16 HBE细胞恶变过程中的 K- ras基因Exon1和 P15基因 Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术对乙酸镍在诱导 16 HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果 :K- ras基因 Exon1和 P15基因 Exon2未发生改变。本实验所选用的 7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带 ,条带数在 1- 6条之间。 7条引物中 P4、P7二条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余 5条引物均有差异 ,对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论 :P15基因第 2外显子和 K- ras基因第 1外显子 (包括第 12、 13密码子 )可能不是乙酸镍作用的靶部位。在乙酸镍诱发细胞恶性转化过程中 ,基因组变得逐渐不稳定。

原发性非小细胞肺癌(NSCLC)中MTS2/p15基因丢失的研究

目的探讨ＭＴＳ２／ｐ１５基因缺失与人体非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）的发生及发展的相关性。方法采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，分别检测１６０例不同病理类型及分期的肿瘤组织，１０例非癌性肺组织及２例胎肺组织中ｐ１５基因的纯合性丢失。结果１６０例ＮＳＣＬＣ组织中ｐ１５基因的丢失率以腺癌为最高６４．７％，鳞癌其次４３．９％，混合型鳞腺癌为最低３７．０％，１０例非癌性肺组织及２例胎肺组织均未见有ｐ１５基因的丢失。经ＴＮＭ分期分析表明，Ⅰ期ｐ１５基因丢失率为３４．６％，Ⅱ期为４７．４％，Ⅲ期为６１．４％，Ⅲ期的ｐ１５丢失率明显高于Ⅰ期（Ｐ＜０．００５）。结论ＭＴＳ２／ｐ１５基因缺失除与ＮＳＣＬＣ的发生相关外，还可能涉及到患者病程的进展。

多发性骨髓瘤中p15^(INK4B)和p16^(INK4A)基因高甲基化的检测

为探索p15 INK4B和p16INK4A基因在多发性骨髓瘤中的甲基化的表达 ,采用敏感的甲基化特异的MSP PCR测定方法 ,检测了 2 4例多发性骨髓瘤 (MM ) p15 INK4B和p16INK4A基因甲基化的情况。结果显示 ,MM中 p15 INK4B和 p16INK4A基因甲基化发生率分别为 70 .8% (17/ 2 4 )和 5 8.3% (14/2 4 ) ,产物分别为 148bp和 15 0bp的片段 ,其中 2例Ⅱ期和 2例Ⅲ期的有浆细胞瘤的MM患者发生 2个基因同时甲基化 ,有 5例 2个基因都没有发生甲基化。这 5例的瘤细胞均为分化较成熟的小浆细胞。结论提示 ,p15 INK4B和 p16INK4A基因甲基化在MM细胞中有一定的发生率 。