可诱导表达Mesp1的慢病毒载体构建及P19细胞稳定表达系的建立

Mesp1属于b HLH转录因子家族,对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能,本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体,转染进P19细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后,成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1基因的细胞系P19-Mesp1,为研究Mesp1心脏发育相关功能提供有用的细胞研究模型。

多肽^(301)LARSLKT^(307)抑制心肌分化的细胞实验研究

目的前期发现多肽^(301)LARSLKT^(307)可在动物水平显著抑制胚胎期心脏发育。该研究拟进一步在P19细胞系水平探究^(301)LARSLKT^(307)抑制心肌分化的作用和机制。方法利用PepDraw Tool、Uniprot和ProtParam在线生物信息学分析网站,对多肽301LARSLKT307的结构、保守性和理化性质进行生物信息学分析。在荧光显微镜下观察FITC标记的多肽^(301)LARSLKT^(307)进入P19细胞的情况。通过倒置显微镜观察多肽^(301)LARSLKT^(307)对P19细胞分化的影响。实时定量PCR及蛋白质免疫印迹法检测多肽对心肌分化标志基因肌钙蛋白cTnT和转录因子GATA4表达的影响。实时定量PCR检测多肽对Notch1信号通路关键分子Notch1和下游Hey1及Hey2的影响。结果生物信息学分析结果显示多肽位于其前体蛋白Talin的301~307氨基酸位点,其分子量小、结构稳定、亲脂性高,且前体蛋白保守性高。荧光显微镜下可见FITC标记的多肽301LARSLKT307可以穿过细胞膜进入P19细胞内。与对照组比较,多肽组细胞部分坏死,生长形态紊乱,细胞厚薄不一。实时定量PCR与蛋白质免疫印迹法检测显示,与对照组比较,多肽组的分化相关基因GATA4及cTnT的mRNA及蛋白表达量均有不同程度下降。实时定量PCR检测显示,与对照组比较,多肽组Notch1通路的相关基因Notch1、Hey1及Hey2的mRNA表达均有不同程度下降。结论多肽^(301)LARSLKT^(307)可能是通过抑制Notch1通路关键因子的表达发挥抑制心肌分化的生物功能。