人免疫缺陷病毒gag p20蛋白表达产物的纯化和鉴定

将人免疫缺陷病毒(HIV)gag p20基因插入表达质粒pBV220,得到重组表达质粒pCY7.在大肠杆菌中高效表达了p20蛋白.Western blot结果显示,大肠杆菌表达的p20蛋白能被抗p17单克隆抗体识别.用脱氧胆酸裂解重组表达菌,得到上清和沉淀两部分,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,p20蛋白主要存在于沉淀中.经用盐溶液洗涤2次后,沉淀中p20蛋白的纯度达到27.4％.再用1mol/L脲溶液洗2次沉淀,p20蛋白纯度提高到58.1％.用6 mol/L脲溶液溶解沉淀,上肝素亲和层析柱,用6 mol/L脲洗脱,得到4个蛋白峰.p20蛋白主要存在于第3峰,凝胶电泳和扫描分析表明,p20蛋白纯度为84.2％。

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p20的原核表达

牛病毒性腹泻是由黄病毒科、瘟病毒属中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛引起的一种传染病,是一种全球性牛传染病。为了在原核表达系统表达BVDV非结构蛋白p20,并分离纯化蛋白进行晶体学研究。首先对BVDV-1 p20蛋白基因进行密码子优化,合成后克隆到pET30表达载体上。测序鉴定成功的pET30-p20表达质粒转化大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导获得的p20蛋白经过Ni柱、分子筛纯化。最终,经过多重缓冲溶液的筛选,p20蛋白可以稳定存在于含有5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5%甘油、150 mmol/L氯化钠(pH8.0)的Tris-HCl缓冲液中。高纯度均一性的p20蛋白获得,为后续p20晶体学研究以及单克隆抗体的制备提供原核表达纯化方案。

CTV强弱毒分离株中p20的表达特征及其对SA通路相关基因的影响

为明确柑橘衰退病毒(CTV)强弱毒分离株中沉默抑制子p20的表达特性及其对SA通路关键基因的转录水平,采用RT-PCR、 cDNA克隆及基因组测序等技术获得p20基因序列,运用MEGA7和DNAMAN软件对CTV强弱毒分离株的p20氨基酸序列进行系统进化树构建和比对分析.结果表明,中国弱毒分离株CTLJ与T30,T358之间的亲缘关系最近,同源性为98.35%.进一步通过Western blot分析表明,CTV强分离株CT14A在甜橙嫩皮中p20的表达水平显著高于弱毒分离株CTLJ,然后探究了这两种强弱毒株间p20的沉默抑制能力是否有差异,结果表明强毒分离株CT14A和弱毒分离株CTLJ的p20蛋白均具有沉默抑制子活性,但是二者沉默抑制活性无显著差异.最后,RT-qPCR技术定量分析结果表明,烟草中瞬时表达p20会诱导SA信号通路关键基因PR1,PR1a和NPR1的转录水平发生变化.

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDVP20及P14基因,并将其插入到pET-28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3)宿主菌中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测,pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白,pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白,结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达,表达出的蛋白大小与预期结果相符.

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX-HTb,并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达;P14蛋白在BL21(DE3)pLysS中表达量较低,而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明,P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western-blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带,推测这两种蛋白可能存在构象表位。

苏云金杆菌辅助蛋白P20对营养期杀虫蛋白Vip3A表达的影响

为检测苏云金杆菌辅助蛋白P20对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20基因与vip3A基因相连构建了重组质粒pHVP20,然后电激转化至Bt中进行了共表达,以仅携带vip3A基因的质粒pHPT3作为对照质粒。Westernblot结果显示,当vip3A基因和p20基因在Bt无晶体缺陷株CryB中共表达时,Vip3A蛋白的最大表达量约是其在CryB(pHPT3)菌株中单独表达的1.5倍。生物测定结果表明,CryB(pHVP20)和CryB(pHPT3)菌株对初孵斜纹夜蛾幼虫的LC50值分别为48.79μg/mL和78.00μg/mL,这说明P20蛋白可以促进vip3A基因在Bt中的表达,但对提高Vip3A蛋白的杀虫毒力没有显著性帮助。