P21活化激酶4在胃肠道间质瘤中的表达及意义

目的通过研究不同危险度胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)中P21活化激酶4(P21-activated kinase 4,PAK4)的表达量,探讨PAK4与GIST危险度的关系。方法选取2020年10月至2021年4月秦皇岛市第一医院病理诊断为GIST患者24例,根据共识将患者分为高危组、中危组、低危组,通过病理切片来确定不同危险度组的PAK4的表达量,并根据Callow计算方法对不同危险度组进行评分。结果PAK4随着GIST危险度增加表达升高,并且与正常对照组织及瘤旁组织相比,GIST中的PAK4表达量升高。结论PAK4表达量与GIST危险度相关,并且随着危险度升高,表达量也升高。

p21活化激酶4致癌机制及与消化系统恶性肿瘤发生发展的关系

p21活化激酶4(PAK4)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在多种消化系统肿瘤中过表达,是肿瘤细胞信号转导的关键因子之一。PAK4过表达与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、免疫逃逸及耐药性有关。在消化系统肿瘤中,PAK4可通过影响细胞周期、细胞凋亡及细胞骨架重塑等生物学过程,促进肿瘤的恶性行为。多项研究表明,PAK4抑制剂显示出抑制肿瘤增殖和转移的潜力,在联合化疗中具有较好的应用前景。

miR-193b-3p、PAK4过表达对人结肠癌细胞增殖凋亡和迁移侵袭的影响及靶向关系

目的观察微小核糖核酸193b-3p(miR-193b-3p)、P21活化蛋白激酶4(PAK4)过表达对人结肠癌细胞系HCT116细胞增殖凋亡和迁移侵袭的影响,并验证两者的靶向关系。方法体外培养人正常结肠黏膜上皮细胞FHC及人结肠癌细胞HCT116、SW480、LoVo,采用RT-PCR检测各细胞miR-193b-3p、P21活化蛋白激酶4(PAK4)mRNA。取生长状态良好的对数生长期HCT116细胞,分为4组,miR-NC组转染miRNA阴性对照、miR-193b-3p组转染miR-193b-3p模拟物、miR-193b-3p+PAK4-NC组转染miR-193b-3p模拟物+P21活化蛋白激酶4(PAK4)空载体、miR-193b-3p+PAK4组转染miR-193b-3p模拟物+PAK4过表达载体,分别采用RT-PCR、CCK-8试验、流式细胞术、Transwell实验检测各组细胞miR-193b-3p、PAK4 mRNA表达及增殖活性、凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数。采用生物信息学软件Target Scan7.2预测miR-193b-3p与PAK4的靶向关系,并采用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果过表达miR-193b-3p后,HCT116细胞增殖活性、迁移及侵袭能力均明显下降,凋亡率明显升高,PAK4 mRNA表达水平降低(P均<0.05)。上调PAK4表达能够部分逆转过表达miR-193b-3p对HCT116细胞增殖活性、迁移及侵袭能力的抑制及对凋亡的促进作用(P均<0.05)。双荧光素酶报告基因显示miR-193b-3p能靶向结合PAK4的3'UTR区,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。结论miR-193b-3p过表达可抑制HCT116细胞增殖、迁移及侵袭,并促进其凋亡,miR-193b-3p与PAK4存在靶向关系。

miR-193b-3p过表达的HCT116外泌体对HUVEC增殖凋亡、迁移、血管形成影响及其与PAK4靶向关系

目的观察微小核糖核酸193b-3p(miR-193b-3p)过表达的人结直肠癌(CRC)细胞(HCT116)外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖凋亡、迁移、血管形成影响,并分析miR-193b-3p与p21活化蛋白激酶4(PAK4)的靶向关系。方法收集CRC患者血清和HCT116细胞上清外泌体,透射电镜实验和纳米颗粒示踪分析观察和鉴定外泌体,RT-q PCR实验检测外泌体miR-193b-3p和PAK4 m RNA。取人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并分组,PBS组加入100μL的PBS,HCT116-Exo组加入100μL的HCT116细胞外泌体,HCT116-Exo+GW4869组先用GW4869(10μmol/L)处理30 min,然后加入100μL的HCT116细胞外泌体,采用Ed U实验、Transwell实验和成管实验检测各组HUVEC细胞增殖、迁移和血管形成能力。取对数生长期的HUVEC细胞,并分为miR-NC组、miR-193b-3p组,miR-NC组与转染miRNA阴性对照(miR-NC)的HCT116细胞外泌体共培养,miR-193b-3p组与转染miR-193b-3p模拟物(miR-193b-3p mimics)的HCT116细胞外泌体共培养,采用CCK8实验、流式细胞术实验和成管实验检测各组HUVEC细胞活性、细胞周期、细胞凋亡和血管形成能力。双荧光素酶报告基因系统检测miR-193b-3p和PAK4的靶向关系。结果CRC患者血清和细胞外泌体miR-193b-3p表达升高,PAK4 m RNA表达降低(P均<0.05);CRC细胞外泌体可促进HUVEC细胞的增殖、迁移和血管形成(P均<0.05);过表达CRC细胞外泌体miR-193b-3p增加HUVEC细胞活力和血管形成、加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡(P均<0.05);miR-193b-3p直接靶向PAK4抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。结论CRC血清、癌细胞外泌体miR-193b-3p表达升高,加入HCT116细胞外泌体的HUVEC细胞增殖、迁移和血管形成能力增强,加入转染miR-193b-3p mimics HCT116细胞外泌体的HUVEC细胞增殖、S期占比、血管形成能力升高及G_(0)/G_(1)期占比、凋亡率下降,miR-193b-3p与PAK4存在靶向关系。

沉默p21活化激酶4基因对骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨沉默p21活化激酶4(PAK4)基因对人多发性骨髓瘤细胞U266增殖、迁移和侵袭的影响。方法采用U266细胞构建稳定细胞系,将细胞随机分为正常对照组、阴性对照组(转染shRNA慢病毒)、shRNA-PAK4组(转染shRNA-PAK4慢病毒),采用MTT法检测细胞活力,流式细胞实验检测细胞周期,划痕实验检测细胞迁移率,Transwell实验检测细胞侵袭能力,免疫印迹(Western blot)实验检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达及细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化水平。结果与正常对照组及阴性对照组比较,shRNA-PAK4组细胞活力、细胞迁移率、细胞侵袭数目均降低,细胞周期G1期延长,Cyclin D1、p21、MMP-9及p-ERK1/2表达量下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论下调PAK4能显著抑制人多发性骨髓瘤细胞U266的增殖、迁移及侵袭。

p21活化激酶4在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的:探讨p21活化激酶4(PAK4)在人非小细胞肺癌细胞系及人非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用Western blot及实时荧光定量PCR检测人支气管上皮(HBE)细胞、非小细胞肺癌细胞(A549、NCI-H520、NCI-H460和NCI-H596细胞)、20例新鲜非小细胞肺癌组织及相应的癌旁组织中PAK4的表达情况;采用免疫组化检测210例非小细胞肺癌组织PAK4的表达情况;采用Kaplan-Meier法评估非小细胞肺癌患者术后5年生存率;用Cox比例风险模型分析PAK4对患者预后的影响。结果:非小细胞肺癌细胞(A549、NCI-H520、NCI-H460和NCI-H596细胞)PAK4蛋白及mRNA表达均显著高于HBE细胞(P<0.05);20例非小细胞肺癌组织中PAK4蛋白及mRNA表达高于癌旁组织PAK4蛋白及mRNA表达(P<0.05);10例转移性非小细胞肺癌组织PAK4 mRNA表达显著高于10例原发性非小细胞肺癌组织(P<0.05);免疫组化染色结果示210例非小细胞肺癌PAK4评分显著高于对应的癌旁组织。临床资料分析显示PAK4蛋白表达与非小细胞肺癌的分化程度、淋巴结转移、远处转移及临床分期有关(P<0.05);PAK4高表达组患者5年生存率显著低于PAK4蛋白低表达组患者(logrank检验,P<0.05),PAK4蛋白表达是非小细胞肺癌患者的独立预后因素。结论:PAK4蛋白高表达是非小细胞肺癌患者死亡的独立危险因素。

胃癌细胞中p21活化激酶4的表达和定位

目的构建真核表达载体pEGFP-PAK4,利用它鉴定p21活化激酶4(PAK4)在胃癌细胞中的定位,并检测外源性和内源性PAK4在胃癌细胞中的表达。方法以pCAN2-MYC-PAK4为模板,采用PCR法进行人PAK4编码序列的扩增,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。将pCAN2-MYC-PAK4质粒瞬时转染到胃癌BGC-823细胞中,用Western blot方法检测MYC-PAK4融合蛋白的表达;并用Western blot方法检测不同胃癌细胞系中内源性PAK4的表达;瞬时转染pEGFP-PAK4到胃癌BGC-823细胞中,用激光扫描共聚焦显微镜观察PAK4的定位。结果(1)hPAK4编码序列被成功克隆至真核表达载体pEGFP-C1中;(2)证实了MYC-PAK4融合蛋白及内源性PAK4在胃癌细胞中的表达;(3)转染pEGFP-PAK4后,在胃癌BGC-823细胞胞质内可见明亮的绿色荧光。结论成功地构建了pEGFP-PAK4载体,证实了外源性和内源性PAK4的表达,证明在胃癌BGC-823细胞中PAK4主要定位于细胞质,为进一步研究PAK4的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。

姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察姜黄素对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法分别用20 ng/ml TNF-α、20μmol/L姜黄素、20 ng/ml TNF-α联合20μmol/L姜黄素作用于体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,MTS/PMS法检测VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法分别测定VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。结果(1)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs增殖无显著作用(P>0.05)。与TNF-α组比较,姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的大鼠VSMCs的增殖(P<0.01);(2)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),TNF-α的这一作用能被姜黄素所抑制(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达无显著作用(P>0.05)。结论一定剂量的姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。

P21活化激酶4在NSCLC中的表达及临床意义

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织中P21活化激酶4(PAK4)的表达及临床意义。方法采用免疫组化方法验证154例NSCLC肿瘤组织PAK4表达情况,并分析其与临床因素以及预后的关系,同时采用酶联免疫吸附法分别在218例NSCLC患者及128例健康对照者的血浆中检测PAK4的浓度。结果在154例NSCLC肿瘤组织中,有115例(81.2%)表现为PAK4阳性表达,而对应的正常肺组织中仅17例表现为阳性(11.0%)。肿瘤组织PAK4的表达与患者性别、年龄、病理分化、脉管瘤栓、T、N及TNM分期均无统计学相关性。PAK4表达阴性、弱阳性、阳性患者的5年生存率分别为65.3%、50.1%和32.2%。多因素分析显示,PAK4与TNM分期均为影响NSCLC预后的独立因素。在218例NSCLC患者血浆中,PAK4中位浓度为2.55 ng/ml,显著高于128例健康对照者(1.50 ng/ml,P<0.001),其ROC曲线下面积为0.766。Youden指数最大为0.49时,PAK4浓度为2.24 ng/ml作为临界值,其用于诊断NSCLC的敏感度和特异度分别为61.86%、86.72%。结论 NSCLC肿瘤组织中PAK4表达明显增强,并可作为预后相关的标志物。NSCLC患者血浆中PAK4浓度明显升高,并具有一定的诊断价值,值得进一步验证。

p21活化激酶4及其抑制剂研究进展

p21活化激酶4(p21-activated kinase4,PAK4)为小G蛋白Rho家族的关键下游效应器,通过多种机制影响肿瘤细胞的侵袭转移、增殖、存活及凋亡,对肿瘤的发生发展起着重要作用。PAK4在多种肿瘤细胞中过度表达,并成为极具研究前景的药物靶点。近年来,已经陆续发现了多种类型的PAK4抑制剂,主要对PAK4的结构特征、在肿瘤的发生发展中PAK4的作用机制以及PAK4抑制剂的研究进展等做总结和阐述。

miR-214-5p靶向PAK4对缺血再灌注大鼠的心肌损伤和免疫反应的调节作用

目的:探讨微小RNA-214-5p(miR-214-5p)靶向p21活化蛋白激酶4(PAK4)对缺血再灌注(I/R)大鼠的心肌损伤和免疫反应的作用。方法:将健康雄性SD大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组、Ad-Scramble组和Ad-miR-214组(n=9)。在大鼠左心室前壁6个不同的位点注入腺病毒;4 d后,缝合左前部下行冠状动脉构建I/R模型。RT-qPCR检测miR-214的表达水平,HE染色观察心肌损伤,ELISA检测心肌损伤标志物(CK-MB、Mb和cTnI)和炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,试剂盒检测MDA含量和SOD活性,基因软件预测靶基因并通过双萤光素酶报告验证,Western blot检测caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、PAK4、p-Akt和p-mTOR表达水平。结果:miR-214在I/R大鼠心肌细胞中低表达(P<0.01);miR-214-5p过表达减轻I/R大鼠心肌损伤程度,下调CK-MB、Mb和cTnI表达,降低心肌细胞凋亡率,上调Bcl-2表达,下调Bax、caspase-3和caspase-9表达,提高SOD活性,降低MDA、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P<0.01);miR-214-5p与PAK4在3’-UTR存在结合位点,miR-214-5p过表达上调PAK4、p-Akt和p-mTOR表达(P<0.01)。结论:miR-214-5p过表达靶向PAK4减轻I/R大鼠的心肌损伤,并抑制心肌细胞凋亡、氧化应激反应和炎症反应,同时激活PI3K/Akt/mTOR通路。

阿司匹林对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察阿司匹林(ASA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,分别用20 ng/mL TNF-α、1 mmol/L ASA、2 mmol/L ASA、20 ng/mL TNF-α+1 mmol/L ASA、20 ng/mL TNF-α+2 mmol/L ASA作用24 h,并设立相关对照组进行比较。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK表达。结果 (1)与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用ASA对大鼠VSMCs的增殖无明显作用(P>0.05)。TNF-α联合ASA组与TNF-α组比较,联用能明显抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖(P<0.01)。(2)与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),单独应用ASA对二者的表达无明显作用(P>0.05)。TNF-α联合ASA组与TNF-α组比较,联用可显著降低这两种蛋白的表达水平(P<0.05)。结论一定剂量的ASA可明显抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK蛋白的表达。

PAK4-LIMK1-Cofilin信号通路对非小细胞肺癌迁移及侵袭能力的影响

目的:探讨p21活化激酶4(PAK4)对非小细胞肺癌(NSCLC)侵袭和迁移能力的影响及相关机制。方法:PAK4-siRNA或阴性对照转染A549和NCI-H520细胞株,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测细胞PAK4 mRNA和蛋白表达水平,Transwell小室法检测其对细胞侵袭和迁移能力的影响;Western blot检测其LIMK1、cofilin及其磷酸化水平;免疫共沉淀检测PAK4和LIMK1蛋白是否直接绑定;体外激酶分析实验检测LIMK1是否是PAK4的激酶底物;Western blot检测10例非小细胞肺癌组织中PAK4和磷酸化LIMK1的相关性;PAK4-siRNA和LIMK1质粒共转染A549和NCI-H520细胞后观察细胞迁移和侵袭能力变化。结果:沉默PAK4后A549和NCIH520细胞迁移和侵袭能力明显减弱(P<0.05);LIMK1和cofilin蛋白水平无显著变化,而磷酸化LIMK1和磷酸化cofilin水平显著下调;免疫共沉淀结果示PAK4与LIMK1相互绑定;激酶分析实验结果显示,激酶缺陷型PAK4(K350M)使LIMK1磷酸化的作用显著低于野生型PAK4或活化型PAK4(S445N)(P<0.05)。Western blot检测结果示非小细胞肺癌组织中PAK4表达上调的程度与磷酸化LIMK1含量呈正相关(P<0.05);PAK4-siRNA和LIMK1质粒共转染A549和NCI-H520细胞后,迁移和侵袭细胞数均高于PAK4-siRNA转染组(P<0.05)。结论:PAK4通过直接磷酸化LIMK1而促进非小细胞肺癌的迁移及侵袭能力。

p21活化激酶4在恶性肿瘤进展中的生物学作用及其研究进展

p21活化激酶4(PAK4)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白家族的一员,在进化上高度保守,通过参与体内多条信号转导通路,影响肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭、转移及凋亡等过程,对肿瘤的发生发展有着重要的作用。恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康,近年来,随着对恶性肿瘤的深入研究,发现PAK4在肿瘤进展过程中承担着重要的生物学作用。本文就PAK4在相关恶性肿瘤进展中的生物学作用及其研究进展综述,以期能为未来相关靶向药物开发及相关的临床应用提供理论参考。

3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位

目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。

miR-145-5p通过靶向PAK4促进非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性

目的研究miR-145-5p通过靶向p21活化激酶(PAK)4对非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性的作用及机制。方法RT-qPCR检测miR-145-5p mRNA和PAK4 mRNA的表达,利用Lipofectamine2000将miR-NC(miR-NC组)、miR-145-5p mimic(miR-145-5p mimic组)、miR-145-5p inhibitor(miR-145-5p inhibitor组)、pc-PAK4质粒分别或联合转染进入A549/GR细胞,未转染的A549/GR细胞为对照组。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞法检测细胞凋亡,双荧光素酶报告检测靶向关系,Western印迹检测PAK4蛋白相对表达水平。在裸鼠左腋下皮下注射转染过的A549/GR细胞,分为空白组、miR-145-5p mimic组、pc-PAK4组、miR-145-5p mimic+pc-PAK4组。每隔一天给每只小鼠口服吉非替尼(100 mg/kg)。第24天颈椎脱位法处死裸鼠,完整取出皮下肿瘤,电子天平称重,RT-PCR检测小RNA和靶基因表达,TUNEL染色检测凋亡。结果与正常肺细胞BEAS-2B相比,A549和A549/GR细胞中miR-145-5p明显低表达(P<0.01)。与对照组相比,miR-145-5p inhibitor组A549/GR细胞活性从24 h开始明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.01,P<0.05);miR-145-5p mimic组A549/GR细胞活性从36 h开始明显降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.01,P<0.05)。miR-145-5p对野生型PAK4荧光素酶活性有明显下调作用(P<0.01),对突变型PAK4荧光素酶活性没有明显作用(P>0.05)。共转染pc-PAK4明显逆转miR-145-5p高表达对A549/GR细胞作用(P<0.01)。miR-145-5p高表达明显减小A549/GR移植瘤体积,减轻A549/GR移植瘤重量,明显上调miR-145-5p mRNA表达,明显下调PAK4 mRNA表达,明显上升细胞凋亡率;共转染pc-PAK4明显逆转miR-145-5p高表达对A549/GR移植瘤作用(P<0.01)。结论miR-145-5p通过靶向PAK4促进非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性。

PAK4在乳腺癌及良性乳腺病变中的表达及意义

目的探讨p21活化激酶4(p21-activatedkinase-4,PAK4)在乳腺癌发病、发展及转移过程中的作用。方法采用免疫组化SP法检测35例正常乳腺组织、22例乳腺囊性增生病、28例乳房纤维腺瘤、37例乳腺癌(其中非浸润性癌7例,早期浸润癌9例,浸润癌21例)及13例乳腺癌转移瘤组织中的PAK4含量,比较各类组织中PAK4的表达特点与分布特征。结果 PAK4表达主要位于胞浆,胞核偶有少量表达,而乳腺腺体细胞外基质中基本不表达;正常乳腺组织、良性病变(乳腺囊性增生病和乳腺腺瘤)、乳腺癌和乳腺癌转移瘤组织中的PAK4表达总体阳性率依次升高;乳腺非浸润性癌、早期浸润癌、浸润癌组织中PAK4的表达阳性率亦呈依次升高趋势。结论 PAK4与乳腺癌的演进和转移密切相关,PAK4及其基因有可能成为乳腺癌诊断和治疗的新靶点。

Pak4在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

目的:检测子宫内膜癌组织标本中Pak4及其活性形式p-Pak4^(ser474)的表达,分析其与临床病理参数的关系。方法:免疫组化法检测子宫内膜组织中Pak4及pPak4^(ser474)表达,应用免疫组化评分半定量分析Pak4表达与临床病理参数的关系。结果:正常子宫内膜组织、不典型增生内膜、子宫内膜癌和淋巴结转移灶中Pak4表达分别为4.00±2.88、7.20±1.10、9.69±2.83和12.00±0.00,p-Pak4^(ser474)表达分别为2.87±2.28、6.80±1.10、8.81±3.04及11.60±1.27,差异均有统计学意义(P<0.001)。子宫内膜癌组织中Pak4及p-Pak4^(ser474)表达与FIGO分期(P=0.003,0.001)、细胞分化(P=0.001,<0.001)、肌层侵犯(P=0.029,0.009)及脉管浸润(P=0.046,0.005)呈正相关。结论:Pak4及p-Pak4^(ser474)在内膜癌组织中高表达,Pak4可能促进内膜癌的恶性进展。

miR-21-5p靶向JAK/STAT信号通路抑制Th1细胞极化

目的探讨miR-21-5p对1型辅助性T细胞(Th1细胞)极化相关信号通路的调控作用。方法提取小鼠脾单个核细胞,用免疫磁珠阴性分选试剂盒分离初始(naive)CD4^(+)T细胞,用抗小鼠CD3ε,CD28和白细胞介素4(IL-4)单克隆抗体及小鼠IL-12和IL-2混合因子诱导体系诱导初始CD4^(+)T细胞向Th1细胞极化,同时转染miR-21-5p模拟物或模拟物对照,分别命名为Th1诱导组、诱导+模拟物对照组和诱导^(+)miR-21-5p模拟物组,72 h后用流式细胞术检测CD4和干扰素γ(IFN-γ)双阳性(CD4^(+)IFN-γ^(+))细胞百分比;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Th1细胞极化相关关键转录因子和细胞因子mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化相关通路关键蛋白及其磷酸化水平。结合双荧光素酶报告系统验证miR-21-5p作用靶标关键细胞因子IFN-γ、信号通路受体IL-12受体β_(1)(IL-12Rβ_(1))和信号转录与转录激活因子1(STAT1)的表达。结果经免疫磁珠分选获得高表达CD62L的初始CD4^(+)T细胞。与Th1诱导组和诱导+模拟物对照组相比,诱导+miR-21-5p模拟物组CD4^(+)IFN-γ^(+)细胞百分比显著降低(P<0.01);Th1细胞极化相关Janus激酶(JAK)/STAT信号通路关键转录因子STAT1(P<0.01)、STAT4(P<0.05)和T盒21转录因子(T-bet)(P<0.01)mRNA表达显著下调,IFN-γ(P<0.01)和IL-12Rβ_(1)(P<0.05)mRNA表达水平亦显著下调,同时STAT1和STAT4蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结合双荧光素酶报告系统结果表明,miR-21-5p模拟物可分别特异性靶向结合IFN-γ(P<0.01),IL-12Rβ_(1)(P<0.01)和STAT1(P<0.05)基因的3′-非翻译区,而对应靶向位点突变后miR-21-5p模拟物不影响其表达。结论miR-21-5p可靶向下调IFN-γ,IL-12Rβ_(1)和STAT1表达,抑制IL-12和IFN-γ介导的JAK/STAT信号通路活化,从而抑制Th1细胞极化。

miR-502-3p抑制结肠癌细胞生长和迁移的作用及机制研究

目的探讨miR-502-3p抑制结肠癌生长和迁移的相关机制。方法收集2020年11月至2021年12月在嘉兴市第二医院肛肠外科经手术切除且无远处转移的10例结肠癌患者的癌组织及癌旁正常结肠组织,比较miR-502-3p表达水平。取HCT116细胞株构建miR-502-3p模拟物、模拟物对照稳转细胞,观察miR-502-3p对细胞增殖、侵袭、凋亡及生长的影响;取10只裸鼠分别腋下接种所构建的稳转细胞,比较接种miR-502-3p模拟物与模拟物对照裸鼠成瘤情况。采用双荧光素酶报告基因检测miR-502-3p与核转运蛋白α4(KPNA4)的靶向结合关系。观察KPNA4对经miR-502-3p干预后细胞侵袭、凋亡及生长以及KPNA4、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的影响,进一步分析KPNA4通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路发挥作用的机制。结果结肠癌组织中miR-502-3p表达水平明显低于癌旁正常组织(P=0.028)。相较于模拟物对照组,miR-502-3p模拟物组HCT116细胞株在24、48、72、96 h时增殖能力均明显减弱(均P<0.05),侵袭能力亦明显减弱,细胞凋亡能力增强,且出现细胞周期G1阻滞现象,KPNA4、N-cadherin表达量均明显降低(均P<0.01),E-cadherin表达量明显升高(P<0.01)。相较于模拟物对照,接种miR-502-3p模拟物裸鼠肿瘤生长缓慢,肿瘤体积和重量均有所降低,第23天时比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-502-3p模拟物能明显降低野生型KPNA4的荧光素酶活性(P<0.001),但对突变型KPNA4的荧光素酶活性无明显影响(P=0.158)。联合KPNA4后,miR-502-3p干预后的HCT116细胞株侵袭和生长能力均增强,凋亡能力下降,KPNA4、N-cadherin表达量均明显升高(均P<0.01),E-cadherin表达量无明显变化(P>0.05)。相较于KPNA4过表达组,KPNA4过表达+MAPK抑制剂组在24、48、72、96 h的细胞增殖能力均明显降低(均P<0.05),细胞侵袭和生长能力均明显减弱,细胞凋亡能力增强。结论miR-502-3p可抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和生长,可能是通过抑制KPNA4/MAPK信号通路实现的。