青黛复方对K-562细胞Bcr/Abl融合基因及p210蛋白表达的影响

目的探讨青黛复方对K-562细胞调亡、Bcr/Abl融合基因及p210蛋白的影响。方法以不同浓度青黛复方(0、2.5、5、7.5、10和20mg/ml)处理K-562细胞24h后,采用半定量RT-PCR技术检测各组Bcr/Abl融合基因的表达,Western blot技术检测p210Bcr/Abl蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果随药物作用浓度升高,K-562细胞凋亡率呈浓度依赖性增加;Bcr/Abl在mRNA和蛋白水平均呈浓度依赖性下调,尤以10mg/ml和20mg/ml处理组更为显著。结论青黛复方能部分抑制K-562细胞Bcr/Abl的表达并呈浓度依赖关系,其对慢性髓细胞性白血病(CML)的疗效可能是通过促进细胞凋亡而实现的。

人树突状细胞与K562细胞的融合以及体外诱导p210蛋白特异性CTL的研究(英文)

目的 :探讨人外周血单核细胞来源的树突状细胞 (Dendriticcells ,DC)与人白血病细胞K562融合后 ,能否诱导出 p210蛋白特异性的CTL ,为DC疫苗的临床应用提供理论基础。方法 :外周血来源的贴附单核细胞 ,在人GM CSF(1000U/ml)和IL 4(1000U/ml)作用下 ,培养5～7天后 ,与人白血病细胞K562进行融合 ,融合细胞再与自体的淋巴细胞共同孵育10～14天 ,采用乳酸脱氢酶释放试验分析其对 p210蛋白阳性细胞的杀伤效果。为显示融合效果 ,对照试验组K562细胞用绿色荧光蛋白 (GFP)进行标记。结果 :贴附的单核细胞在GM CSF和IL 4作用下 ,培养5天后 ,约有70 %的DC产生 ,流式细胞仪分析表明 ,这些细胞为HLA DR、HLA A ,B ,C以及CD1α阳性 ,并高表达共刺激分子CD80和CD86。DC与GFP标记的K562细胞融合24h后 ,表达GFP蛋白的细胞中约有60 %呈现出典型的DC形态特征。乳酸脱氢酶释放试验结果表明 ,融合细胞能激活淋巴细胞产生 p210蛋白特异性的CTL。结论 :树突状细胞与肿瘤细胞融合后 ,能诱导出肿瘤特异性的CTL ,显示出DC疫苗抗肿瘤作用的广泛前景。

大黄素对K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用

本研究观察中药大黄素(emodin)对人慢性髓系白血病K562细胞株的增殖及凋亡影响,探讨P210融合蛋白和caspase-3激活在其中的作用。采用MTT法、集落形成试验观察大黄素对K562增殖的影响;Annexin V FITC/PI法、DNA倍体分析及DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡;Western blot检测大黄素作用后不同时间段P210、磷酸化P210、caspase-3前体蛋白及PARP表达水平的变化。结果表明,大黄素能抑制K562细胞增殖,作用48小时的半数抑制浓度(IC50)为38.25μmol/L;Annexin V FITC/PI法、亚二倍体峰(凋亡峰)及DNA片段化检测证实,大黄素能诱导K562细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用K562细胞后P210、磷酸化P210、caspase-3前体蛋白表达水平均有不同程度下调,PARP的活性片段85kD表达增加,这些变化呈时效关系。结论:大黄素能够有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡。P210磷酸化抑制,P210表达下调和caspase-3激活可能参与了该过程。

反义寡核苷酸对K562细胞株恶性表型逆转作用的研究

用人工合成的ｂｃｒ３／ａｂＬ２反义寡聚脱氧核苷酸（ＡＳＯ－ｂ）及无关寡聚脱氧核苷酸（Ｎ－ＯＤＮ）处理人急性红白血病细胞株Ｋ５６２细胞，结果造成了细胞恶性行为的改变。表现为细胞生长减慢、Ｐ２１０蛋白表达受抑、ＤＮＡ的合成减少及集落形成能力下降，从而证明了反义核酸在癌基因表达上的调控和抑制细胞恶性行为的作用。

慢性髓系白血病细胞中SphK-1/S1P信号通路的初步研究

慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。为探讨SphK-1/S1P信号通路元件在CML细胞中的表达情况,研究P210bcr/abl是否涉及到SphK-1/S1P信号通路,首先采用RT-PCR检测bcr/abl阳性的K562细胞和bcr/abl阳性的原代CML细胞中SphK-1和S1P受体mRNA的表达。进一步利用P210bcr/abl特异抑制剂甲磺酸伊马替尼处理bcr/abl阳性的K562细胞和CML原代细胞,然后通过32P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。结果表明:K562细胞经2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理0.5、2、6、24和48小时后,对SphK-1活性抑制强度分别为0.007%、38.9%、34.6%、28.1%和76.1%;CML原代细胞在使用2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理后SphK-1活性较对照下降(16.8-41.9)%。结论:CML细胞中存在SphK-1和S1P的表达,P210bcr/abl具有激活SphK-1的作用。

趋化因子MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达

本文旨在研究MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达,同时观察P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶对MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2mRNA表达的影响。在bcr/abl融合基因阴性和阳性慢性髓系白血病细胞中,采用半定量RT-PCR方法检测MIP-1α、MCP-1、CCR-1、CCR-2mRNA的表达水平。结果表明MIP-1αmRNA和CCR-1mRNA在bcr/abl融合基因阳性细胞中不表达,但在bcr/abl融合基因阴性细胞中表达,而MCP-1mRNA和CCR-2mRNA在bcr/abl融合基因阳性和阴性细胞中均不表达。当P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶被抑制后,MIP-1α和CCR-1的mRNA表达水平恢复至正常水平。结论:P210bcr/abl融合蛋白抑制慢性髓系白血病细胞中MIP-1α和CCR-1mRNA的表达,但对MCP-1和CCR-2mRNA的表达无影响。

设计合成新的大黄素衍生物对慢性髓系白血病细胞株K562及K562/G01的作用

目的:研究设计合成新的大黄素衍生物E19对慢性髓系白血病细胞株K562及耐伊马替尼的K562细胞株K562/G01的增殖、凋亡的影响,探讨其作用的机制。方法:采用MTT比色法、细胞集落形成实验观察E19对K562、K562/G01细胞增殖的影响;应用DAPI染色法和DNA片段化检E19诱导细胞凋亡的作用;Western blot检测E19作用后不同时间段p210^(Ber-Abl)和p-P210^(Bcr-Abl)蛋白的变化。结果:大黄素衍生物E19对K562和K562/G01细胞有明显的抑制增殖、诱导凋亡的作用,K562细胞48 h半数抑制浓度(IC_(50))为(1.20±0.19)μmol/L,K562/G01细胞48 h IC_(50)为(1.22±0.16)μmol/L;DNA片段化检测证实,E19对细胞抑制作用呈量效关系;E19作用于细胞后,P210^(Bcr-Abl)和p-P210^(Bcr-Abl)表达水平均有不同程度下调,并呈量效和时效关系。结论:大黄素衍生物E19能有效抑制K562和K562/G01细胞的增殖并诱导它们凋亡,而P210^(Bcr-Abl)和p-P210^(Bcr-Abl)的活化受抑制在其中发挥重要的作用。

青蒿琥酯对原代慢性粒细胞白血病细胞生长抑制、凋亡诱导及bcr/abl融合基因、P210蛋白、磷酸化SHP-2蛋白表达的影响

目的探讨青蒿琥酯对原代慢性粒细胞白血病细胞生长抑制、凋亡诱导及bcr/abl融合基因、P210蛋白、Src同源区2含域磷酸酶-2(SHP-2)蛋白磷酸化的影响。方法分离培养原代慢性粒细胞白血病细胞,采用不同浓度青蒿琥酯(0、5、10、20μg·mL^(-1))进行干预,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞生长抑制情况;细胞计数法检测细胞生存情况;罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位的变化;电镜观察细胞超微结构的变化;流式细胞术(FCM)检测青蒿琥酯对细胞凋亡及胀亡的影响;荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcr/abl融合基因mRNA表达;Western Blot检测P210、SHP-2及磷酸化SHP-2蛋白表达。结果青蒿琥酯可抑制原代慢性粒细胞白血病细胞的生长,降低细胞存活率和线粒体膜电位水平(P<0.05),且与药物浓度和时间呈现一定的依赖性;不同浓度药物和不同作用时间可导致细胞凋亡率及胀亡率明显升高(P<0.01),同时可降低bcr/abl融合基因mRNA、P210、SHP-2和磷酸化SHP-2蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论青蒿琥酯可通过抑制原代慢性粒细胞白血病细胞的生长,促进其凋亡和胀亡,以及降低bcr/abl融合基因mRNA、P210、SHP-2、磷酸化SHP-2蛋白在原代慢性粒细胞白血病细胞中的表达水平,达到治疗慢性粒细胞白血病(CML)的目的。

人参皂甙Rg1对人慢性粒细胞白血病p210 bcr/abl融合蛋白表达的影响

目的:研究人参皂甙Rg1对人慢性髓细胞白血病敏感株K562细胞p210bcr/abl融合蛋白表达的影响。方法:体外培养K562细胞,经人参皂甙Rg1处理不同时间后,用流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western印迹技术检测细胞内p210bcr/abl融合蛋白表达。结果:人参皂甙Rg1可诱导细胞凋亡,凋亡率并随时间延长而升高;人参皂甙Rg1可下调p210bcr/abl蛋白表达量,并具时间依赖性。结论:人参皂甙Rg1可通过降低p210bcr/abl蛋白水平来诱导K562细胞凋亡,达到有效抗人慢性髓细胞白血病的效果。

小檗胺对人慢性粒细胞白血病细胞发生凋亡的诱导机制研究

目的研究新型p210 bcr／aN抑制剂小檗胺诱导人慢性粒细胞白血病细胞凋亡分子的机制。方法培养表达内源性p210 bcr／abl蛋白的Ph+人慢性粒细胞白血病细胞系K562,用小檗胺按指定时间和剂量干预细胞。应用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)／碘化丙啶(propidium iodide, PI)试剂盒和流式细胞术定量分析凋亡细胞百分比;用cytoperm／cytofix和天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白水解酶-3-McAb-PE定量检测含活化天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)细胞百分比;以免疫共沉淀技术(c-abl抗体)和Western印迹[p-Tyr(pY99)抗体]定量分析p2m bcr／abl蛋白磷酸化;p210 bcr／abl蛋白总量直接用Western印迹(c-abl抗体)检测;H8p90和Hsp70等分子伴侣蛋白水平的变化用Western印迹(Hsp90和Hsp70抗体)。结果48 h IC50浓度小檗胺(8μg／ml)作用48 h后,45．69％K562白血病细胞表达活化的Caspase-3凋亡分子和48．43％白血病细胞发生凋亡。免疫印迹和免疫共沉淀结果显示,低剂量小檗胺可明显抑制白血病细胞内p210 bcr／abl磷酸化:8μg／ml浓度小檗胺处理6 h后,白血病细胞磷酸化p210 bcr／abl蛋白含量仅为对照组的8．41％,而p210 bcr／abl蛋白总量并无变化。小檗胺还能直接下调p210 bcr／abl分子伴侣Hsp90蛋白水平:白血病细胞经8μg/ml浓度小檗胺处理24 h时的Hsp90水平只有对照组的18．37％,而且对能诱导白血病细胞产生凋亡抵抗的Hsp70蛋白水平影响不明显。结论(1)小檗胺是一种新型p210 bcr／abl蛋白磷酸化抑制剂,能通过抑制p210 bcr／abl蛋白磷酸化和诱导Caspase-3通路介导的Ph+白血病细胞发生凋亡; (2)与已知Hsp90抑制剂格尔德霉素(GA)不同,小檗胺能直接下调Hsp90蛋白水平,而对与肿瘤细胞凋亡抵抗有关的Hsp70蛋白表达影响不大,这提示小檗胺可能还是一种新型蛋白分子伴侣Hsp90抑制剂,值得进一步研究。

bcr—abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建慢性粒细胞白血病bcr—abl融合基因的真核表达载体，并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达。方法提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA，经RT—PCR技术扩增得到bcr—abl基因后，将其克隆人真核表达载体pEGFP—N3中，并进行PCR和酶切鉴定。鉴定为阳性的克隆，再进一步进行测序分析。将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达。结果反转录PCR扩增后的产物，经琼脂糖凝胶电泳可以在约874bp处看见一特异性的条带，序列分析证明扩增产物与GeneBank中的bcr-abl基因序列相同。将pEGFP—bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后，经RT—PCR、Westernblotting检测证明表达产物正确。结论成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒，从而为进一步研究其结构和功能，寻找CML诊疗的新方法奠定了基础。