青黛复方对K-562细胞Bcr/Abl融合基因及p210蛋白表达的影响

目的探讨青黛复方对K-562细胞调亡、Bcr/Abl融合基因及p210蛋白的影响。方法以不同浓度青黛复方(0、2.5、5、7.5、10和20mg/ml)处理K-562细胞24h后,采用半定量RT-PCR技术检测各组Bcr/Abl融合基因的表达,Western blot技术检测p210Bcr/Abl蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果随药物作用浓度升高,K-562细胞凋亡率呈浓度依赖性增加;Bcr/Abl在mRNA和蛋白水平均呈浓度依赖性下调,尤以10mg/ml和20mg/ml处理组更为显著。结论青黛复方能部分抑制K-562细胞Bcr/Abl的表达并呈浓度依赖关系,其对慢性髓细胞性白血病(CML)的疗效可能是通过促进细胞凋亡而实现的。

青蒿琥酯对原代慢性粒细胞白血病细胞生长抑制、凋亡诱导及bcr/abl融合基因、P210蛋白、磷酸化SHP-2蛋白表达的影响

目的探讨青蒿琥酯对原代慢性粒细胞白血病细胞生长抑制、凋亡诱导及bcr/abl融合基因、P210蛋白、Src同源区2含域磷酸酶-2(SHP-2)蛋白磷酸化的影响。方法分离培养原代慢性粒细胞白血病细胞,采用不同浓度青蒿琥酯(0、5、10、20μg·mL^(-1))进行干预,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞生长抑制情况;细胞计数法检测细胞生存情况;罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位的变化;电镜观察细胞超微结构的变化;流式细胞术(FCM)检测青蒿琥酯对细胞凋亡及胀亡的影响;荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcr/abl融合基因mRNA表达;Western Blot检测P210、SHP-2及磷酸化SHP-2蛋白表达。结果青蒿琥酯可抑制原代慢性粒细胞白血病细胞的生长,降低细胞存活率和线粒体膜电位水平(P<0.05),且与药物浓度和时间呈现一定的依赖性;不同浓度药物和不同作用时间可导致细胞凋亡率及胀亡率明显升高(P<0.01),同时可降低bcr/abl融合基因mRNA、P210、SHP-2和磷酸化SHP-2蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论青蒿琥酯可通过抑制原代慢性粒细胞白血病细胞的生长,促进其凋亡和胀亡,以及降低bcr/abl融合基因mRNA、P210、SHP-2、磷酸化SHP-2蛋白在原代慢性粒细胞白血病细胞中的表达水平,达到治疗慢性粒细胞白血病(CML)的目的。

用实时定量PCR检测慢性髓系白血病患者的bcr/abl^(P210)融合基因转录本

目的 建立实时定量PCR(RQ PCR)检测慢性髓系白血病(CML)bcr/ablP210融合基因转录本,评价其在CML诊断和微小残留病(MRD)监测中的意义。方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ PCR法对b3a2和ABL阳性模板进行扩增,并检测22例CML患者bcr/ablP210转录本含量。结果 RQ PCR法最低可检测到 10个拷贝 /μl的阳性模板,但重复性较差,而 108 ~102 拷贝 /μl的重复性良好,正常对照无扩增信号。19例初诊CML患者bcr/ablP210转录本绝对含量为 1. 42×102 ~2. 24×105拷贝 /50ng(中位数量 3. 06×104 拷贝 /50ng),ABL纠正后的相对含量为 3% ~687% (中位数 147% )。2例患者骨髓移植后bcr/ablP210转录本下降, 1例患者由慢性期进展为加速期时含量显著增高。结论 RQ PCR方法敏感、可靠,可用于CML患者的诊断和MRD随访监测。

慢病毒介导shRNA稳定干扰P210^(bcr/abl)基因表达的体内外研究

P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用。针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性。P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/ablshRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力;用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/ablmRNA和蛋白的表达。结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/ablshRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。

CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/abl^(P210)融合基因转录本表达的关系

目的通过分析慢性粒细胞白血病(CML)患者转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA与bcr/abl^(P210)融合基因转录本(简称bcr/abl^(P210))的表达水平,探讨两者在CML发病过程中可能的作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测73例CML患者外周血和骨髓中TGF-β1 mRNA及bcr/abl^(P210)的表达水平,以22名健康体检者作为正常对照组。TGF-β1 mRNA与bcr/abl^(P210)的相关性采用Pearson相关分析。结果 CML患者骨髓和外周血样本中TGF-β1 mRNA、bcr/abl^(P210)的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组外周血中TGF-β1 mRNA的表达水平明显高于CML患者骨髓中TGF-β1 mRNA的表达水平(P<0.05),正常对照组TGF-β1 mRNA的表达水平是CML组的11.39倍。相关性分析显示CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/abl^(P210)呈正相关(r=0.53,P<0.01)。结论骨髓TGF-β1 mRNA有可能作为一种新的CML诊疗指标。

BCR/ABL融合基因产物P^(210)在白血病诊断中的临床意义

目的:建立一种用抗ABL单克隆抗体,检测外周血P210BCR/ABL融合基因蛋白,为临床提供:特异、灵敏、快速诊断白血病的新方法。方法:采用WesternBloting印迹法检测68例符合FBA分型的白血病(CML)患者外周血细胞中P210蛋白。结果:CML患者外周血细胞中P210蛋白均为阳性。结论:外周血BCR/ABL融合基因蛋白检测法材料来源方便病人无痛苦,对提高CML患者的明确诊断和预后评估具有特异、可靠、准确、省时的临床应用价值。

稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立

为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×107CFU/ml。结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础。

Ph1染色体及bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病中的诊断意义

目的探讨Ph1染色体和bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断中的意义。方法选择28例慢性粒细胞白血病患者和20例缺铁性贫血患者作为研究对象,采用骨髓细胞短期培养法制备染色体、采用RT-PCR法分析bcr/abl融合基因。结果28例慢性粒细胞白血病患者中,Ph1染色体阳性者25例(89.3%),bcr/abl阳性者26例(92.9%),Ph1和bcr/abl均阳性25例(89.3%),Ph1阴性、bcr/abl阳性1例(3.6%),Ph1和bcr/abl均阴性2例(7.1%)。20例缺铁性贫血患者Ph1和bcr/abl均阴性。结论Ph1染色体、bcr/abl融合基因的检测有助于慢性粒细胞白血病的诊断和鉴别诊断。

RT-PCR一步法检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因

应用RT PCR一步法检测了 42例慢性粒细胞白血病 (CML)患者的bcr/abl融合基因 ,均显示bcr/abl基因阳性 ,其中2 1例为 16 8bp扩增带 ,18例为 93bp扩增带 ,3例同时具有 16 8bp和 93bp二条扩增带。bcr/abl融合基因检测 ,对CML的诊断、治疗及预后判断均有重要意义。RT PCR一步法特异性好 ,敏感性高 ,简单快速 ,可节省试剂 ,值得推广应用。

慢性粒细胞白血病Ph^1染色体和bcr/abl融合基因检测的意义

目的 :探讨 Ph1染色体和 bcr/ abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断中的意义。方法 :选择 95例慢性粒细胞白血病患者和 2 0例缺铁性贫血患者作为研究对象 ,采用骨髓细胞短期培养法制备染色体、采用RT- PCR法分析 bcr/ abl融合基因。结果 :95例慢性粒细胞白血病患者中 ,Ph1染色体阳性者 83例 (87.4 % ) ,bcr/ abl阳性阳性者 90例 (94 .7% ) ,Ph1和 bcr/ abl均阳性 83例 (94 .7% ) ,Ph1阴性、bcr/ abl阳性 7例 (7.4 % ) ,Ph1 和 bcr/ abl均阴性 5例 (5 .3% )。 2 0例缺铁性贫血患者 Ph1 和 bcr/ abl均阴性。结论 :Ph1 染色体、 bcr/ abl融合基因的检测有助于慢性粒细胞白血病的诊断和鉴别诊断。

格列卫对慢性粒细胞白血病病人Ph染色体和bcr/abl融合基因表达影响

目的探讨格列卫治疗Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病病人后骨髓Ph染色体及bcr/abl融合基因表达的变化。方法采用R显带和半定量RT-PCR分别检测11例慢性粒细胞白血病病人服用格列卫前后骨髓标本中Ph染色体和bcr/abl基因的表达。结果用药后9例慢性期慢性粒细胞白血病病人,7例分别在用药3～24个月后染色体检查为Ph染色体阴性,1例用药1个月后其Ph染色体仍为阳性,后失访;1例用药2个月后Ph染色体阳性率为30%;1例急变期慢性粒细胞白血病病人用药6个月后其Ph染色体阳性率为70%;1例加速期慢性粒细胞白血病病人用药12个月后Ph染色体阳性率为60%。服用格列卫的CML病人Ph染色体转阴后仍能检测到bcr/abl基因的表达,但其表达水平较用药前明显降低,差异有显著性(t=3.77、5.13,P<0.01),随着用药时间的延长bcr/abl基因表达逐渐降低。结论格列卫能有效治疗Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病病人,并且对其预后具有重要的意义。

慢性髓系白血病患者移植造血干细胞后bcr/abl融合基因变化的实时定量RT-PCR监测及其意义

为了探讨Ph阳性慢性髓系白血病(CML)患者异基因造血干细胞移植后不同时期bcr/abl融合基因水平变化的实时定量PCR监测及其意义,对21例CML患者骨髓移植后不同时期bcr/abl融合基因水平用实时定量PCR技术进行了连续监测。结果表明:21例bcr/abl融合基因阳性CML患者移植后7例未检测出融合基因,14例移植后1-6月仍可检出不同水平bcr/abl融合基因。动态观察发现,9例bcr/abl融合基因处于较低水平,相对数在0.0074%-0.088%,于移植后第3-7月转为阴性。5例符合分子生物学复发标准,融合基因相对数在0.077%-75%。其中1例在骨髓移植后1、2、3个月融合基因相对数分别为0.95%、1.5%、0.16%,于移植后4个月自行转阴性;2例接受同一供者单个核细胞输注后bcr/abl转为阴性;2例发展为临床血液学复发,其中1例经化疗及同供者单个核细胞输注再次缓解,但bcr/abl阳性,另1例不治死亡。结论:对于ph阳性CML患者骨髓移植后连续定量监测bcr/abl融合基因水平可以了解疾病残留状态,预测分子学生物学复发,指导临床治疗,并评价疗效。

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。

原发性血小板增多症患者的骨髓病理学、染色体及JAK2-V617F基因和Bcr-abl(p210)基因表达观察

目的观察原发性血小板增多症(ET)患者的骨髓病理学特点、染色体变化及JAK2-V617F基因和融合基因Bcr-abl(p210)的表达情况。方法 55例ET患者,分别行骨髓涂片检查及骨髓组织病理检查,同时对骨髓组织的染色体及JAK2-V617F基因、融合基因Bcr-abl(p210)进行检测。结果 55例患者中,骨髓涂片观察见骨髓增生活跃34例、增生明显活跃2例、增生低下19例;5例骨髓取材时出现干抽;所有患者粒、红两系均未见明显病态造血,且原始细胞分类计数均<5%;巨核细胞计数中位数为122(0~561)个;41例可见明显巨核系病态造血;所有患者血小板呈大堆分布,并可见大血小板。55例患者中,骨髓组织病理学观察3例可见骨髓基质出血、水肿,造血组织容量中位数为55%;所有患者粒系增生活跃,12例红系增生偏低下;6例可见前体细胞定位紊乱;所有患者巨核细胞有不同程度异常增生;52例可见明显巨核系病态造血;32例可见小巨核细胞,但未见淋巴样小巨核细胞。骨髓组织切片Gomori染色52例呈阳性,其中35例骨髓网状纤维轻度增生(+^++)、17例骨髓明显纤维化(≥+++)。所有患者骨髓组织未发现Ph染色体,但其中2例可见核型异常。55例患者中,JAK2-V617F基因突变35例,全部患者Bcr-abl(p210)基因检测均为阴性。结论 ET患者骨髓病理学特点是巨核细胞系明显增生,并具有病态造血表现,部分患者有JAK2-V617F基因突变。骨髓组织病理检查应作为ET必需的诊断方法。

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的:在慢性粒细胞白血病(慢粒)细胞系K 562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr/ab l融合基因检测方法。方法:以W aller的“L-T DNA PCR”方法为基础,并针对其引物位置设计的缺陷,改进设计了一套DNA-PCR引物,分别提取K 562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA,进行bcr/ab l融合基因扩增,并对扩增片段进行序列测定。结果:运用DNA-PCR方法成功地扩增出了K 562细胞及2名CM L患者外周血基因组的bcr/ab l融合基因片段,随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论:DNA-PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段,结合测序能鉴定融合基因的断裂位点,若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后,还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。

筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因

目的探讨最适退火温度和核酸扩增（PCR）周期，利用筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病（CML）的bcr-abl融合基因类型，并进行PCR荧光定量（RQ—PCR），研究其与疾病的关系。方法通过改变PCR条件，将退火温度由55℃增加到60℃，反应周期由原来的30周期增加到45周期，检测14例22份标本。同时用荧光定量试剂检测标本。结果退火温度为58℃，45周期可测出10^3 copies／μl定量标准品的PCR产物。22份标本6cr-abl融合基因巢式PCR结果均阳性。其中b2a2型9份，b3a2型13份。定量检测18例阳性，量值在10^2-10^6copies／μg，两例急变患者急性期和慢性期有明显差异。结论筑巢式PCR是一种敏感而准确的检测方法，对bcr—abl进行定量有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效及判断疾病预后。

66例血液病患者bcr/abl融合基因、Ph染色体结果分析

CML特异性费城染色体（Philadephia，Ph）是由t（9：22）（q34：11）易位形成。9号染色体原癌基因abl（Abelson protooncogene）易位至22号染色体的断裂点簇集区（breakpoint cluster region，bcr），发生重排，产生bcr／abl融合基因，引起CML的始动突变。融合基因bcr／abl几乎见于所有的慢性粒细胞性自血病、25％-50％的急性B系淋巴细胞性白血病（ALL）和约5％的急性粒细胞性白血病中，本文统计了进行染色体和ber／abl融合基因检查的初诊血液病66例，对其骨髓细胞染色体核型及bcr／abl融合基因进行分析。

温热处理对K562细胞系bcr/abl融合基因mRNA转录和Caspase-3表达的影响

目的观察不同温度刺激对K562细胞bcr/abl融合基因mRNA转录和Caspase-3蛋白表达的影响。方法将培养获得的K562细胞分别进行40℃、43℃、46℃恒温刺激30min,以37℃作为对照;RT-PCR技术检测bcr/abl融合基因mRNA的转录,Westernbloting技术检测Caspase-3的表达。结果K562细胞热刺激30min后,bcr/abl融合基因mRNA的转录随温度升高而下调,Caspase-3的表达随温度升高而上调。结论温热刺激可降低K562细胞内bcr/abl融合基因mRNA的转录,提高Caspase-3的表达。

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p<0.01和p<0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。

Tet-off调控bcr/abl基因表达的细胞系293pT2-P210的建立

慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为:位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tet-off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系,为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2-P210,同时将Tet-off质粒转染293细胞并筛选出单克隆,然后进一步转染pTRE2hyg-LUC质粒,通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tet-off细胞,然后将重组质粒pT2-P210转染到293Tet-off细胞中。结果表明:筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293pT2-P210单克隆细胞。结论:本研究筛选的293pT2-P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tet-off诱导表达系统调控的细胞系,它们适用于bcr/abl融合基因功能及其信号调控机制的深入研究。