非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具有良好的免疫原性,小鼠血清抗体效价为1∶12800。本研究建立的ELISA方法(p22-ELISA)的最佳抗原包被浓度为0.125μg/孔,最佳待检血清稀释度为1∶800,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.384;与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等抗体阳性猪血清无交叉反应,说明特异性好;批内与批间变异系数均低于10%,表明重复性好。利用p22-ELISA方法检测了263份临床猪血清样品,与商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒的符合率为97.7%。【结论】本研究基于原核表达的p22截短体蛋白建立了用于检测ASFV抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ASFV感染诊断和流行病学调查提供了技术支撑。

非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种高度传染性病毒性疾病,发病率和死亡率高达100%,对我国的生猪养殖业造成了毁灭性打击。p22蛋白为ASFV的结构蛋白,本研究构建了重组原核表达质粒pET-32a-p22,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组p22蛋白并纯化,经Western blot鉴定证实重组p22蛋白与ASFV阳性血清有良好的免疫反应性。利用重组p22蛋白免疫Balb/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌p22蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株2D6和5E7。经抗体亚型鉴定两株抗体均为IgG1型;经Western blot鉴定,两株抗体能够特异性识别过表达的p22蛋白。综上,本研究成功表达并纯化了p22重组蛋白,制备了p22单克隆抗体,为进一步探讨p22蛋白的结构功能及其在ASFV中的感染致病机制提供了基础条件。

非洲猪瘟病毒p22蛋白的表达及单克隆抗体制备

为研发非洲猪瘟病毒的免疫诊断学试剂,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒p22蛋白,制备抗p22蛋白单克隆抗体并鉴定其与非洲猪瘟病毒的反应性。结果显示,成功制备重组杆状病毒AcNPV-p22,表达得到大小约22 ku可溶性的重组p22蛋白。Western blot鉴定结果表明,重组p22蛋白可以与非洲猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应。筛选到能够稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3D2、4A7),腹水ELISA效价均高于1∶128 000;单克隆抗体亚类分型鉴定结果表明,重链均为IgG1,轻链均为κ;间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的单克隆抗体能与非洲猪瘟病毒发生特异性反应。综上,利用杆状病毒-昆虫表达系统成功表达了可溶性的非洲猪瘟病毒重组p22蛋白,并制备抗p22蛋白单克隆抗体。

非洲猪瘟病毒P22蛋白的生物信息学分析

为了对靶向研制非洲猪瘟病毒(ASFV)疫苗提供理论参考依据,利用NCBI数据库及相关软件对该病毒KP177R基因编码的P22蛋白进行理化性质、疏水性、抗原性和抗原决定簇、信号肽和跨膜结构域、高级结构、磷酸化和糖基化位点进行分析和预测。结果:P22蛋白为亲水性不稳定蛋白,存在跨膜结构域,不含信号肽;P22蛋白的抗原指数为0.578 6,有7个B细胞优势抗原表位,具有良好的免疫原性;该基因表达蛋白的结构元件主要为α螺旋、β转角、延伸链和无规则卷曲等构成,抗原性及氨基酸表面可及性较好;取阈值0.481 6时位于113处的丝氨酸存在1个N-糖基化位点,阈值为0.5时第7、9、55、76、79、119、136位氨基酸处有磷酸化位点。结论:P22蛋白是不稳定、没有信号肽的跨膜亲水蛋白,为可能抗原且具有7个抗原决定簇,无规则卷曲在高级结构中含量最高,同时拥有多个磷酸化位点和1个糖基化位点。

间接ELISA检测非洲猪瘟病毒P22蛋白原核表达方法建立

非洲猪瘟(ASF)是由属于Asfaviridae家族的非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的。本文主要研究间接ELISA(酶联免疫吸附测定)检测ASFV(非洲猪瘟病毒)P22蛋白原核表达方法建立,并得出了一定的实验成果,本研究中开发的基于重组p22∆TM/p30的间接ELISA显示出高重复性,具有可接受的诊断敏感性和特异性。值得注意的是,这种间接ELISA可以检测针对毒性基因Ⅱ型ASFV的抗体,而其他可用的试剂盒则不能。这些特征对于在毒力基因型II型ASFV流行的地区应用此类测试很有用。

乙型肝炎病毒／P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。

复方七芍降压片对SHR氧化应激及p22phox蛋白表达的影响

目的：观察复方七芍降压片对SHR氧化应激的减弱作用。方法：48只SHR按血压分层随机分为4组,即模型组（SHR-M）、厄贝沙坦组（SHR-E）、低剂量治疗组（SHR-D）、高剂量治疗组（SHR-G）,每组12只,12只WKY大鼠为空白对照组。连续灌胃12周,观察SHR胸主动脉血浆SOD、血清MDA和ROS以及胸主动脉p22phox蛋白的表达的变化。结果：与空白对照组比较,SHR各组血浆SOD明显降低,血清MDA、ROS水平明显升高,胸主动脉p22phox蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：复方七芍降压片通过上调血浆SOD水平,降低血清MDA、ROS浓度,改善SHR氧化应激状态,从而达到降低血压的作用。

滋阴活血方对自发性高血压大鼠氧化应激反应的影响

目的观察滋阴活血方对SHR大鼠氧化应激反应的影响。方法将SHR大鼠50只随机分为空白组、对照组、滋阴活血方低、中、高剂量组,每组各10只。对空白组以生理盐水灌胃,对照组以贝那普利灌胃,对剩余3组分别以低、中、高剂量中药灌胃,4周后检测5组大鼠心、肾组织p22phox蛋白表达进行比较。结果对照组、滋阴活血方组较空白组心、肾组织p22phox蛋白降低,滋阴活血方中、高剂量组无明显差异。结论滋阴活血方对自发性高血压大鼠心肾组织中p22phox蛋白表达具有抑制作用,但作用不及贝那普利。滋阴活血方对p22phox蛋白表达的抑制作用与组方剂量存在一剂量曲线,到一定剂量后量效关系不再是正线性相关。