家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析

为研究家蚕Fhx/P25基因在时空上的调控机制,通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白Fhx/P25基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由Fhx/P25启动子驱动报告基因DsRed的表达载体pSK-P25-DsRed-PolyA,并通过家蚕BmN细胞进行瞬时表达。结果显示:Fhx/P25基因的启动子序列符合真核生物启动子特点,具有丝腺特异性表达启动子的特征,TATA框的保守序列为TATAA,位于-28—-32处,CAAT基序有3个,其中-110—-117和-90—-87处的2个CAAT基序可能具有活性;二级结构分析显示:Fhx/P25启动子区域具有复杂的茎环结构,这可能与蛋白表达的组织特异性、时间性以及活性有关。基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕BmN培养细胞中的瞬时表达。

Bmo-miR-2755*对丝素蛋白基因BmFib-L和BmP25表达的调控作用

为了研究家蚕miRNA对丝素蛋白基因表达的调控作用,采用生物信息学方法筛选获得对家蚕丝素轻链基因（BmFib-L）和P25蛋白基因（BmP25）有潜在调控作用的Bmo-miR-2755＊。利用半定量RT-PCR技术分析Bmo-miR-2755＊及其靶基因BmFib-L、BmP25在家蚕4~5龄期幼虫后部丝腺和5龄3 d幼虫不同组织器官中的表达水平,结果显示三者在后部丝腺组织中的表达水平都较高,呈现严格的时空特异性。以pcDNA3质粒为载体,构建Bmo-miR-2755＊的重组表达载体pcDNA3[ie1-egfpprimiR-2755＊-SV40];以pGL3.0-Basic质粒为载体,分别构建BmFib-L 3＇UTR、BmP25 3＇UTR与荧光素酶报告基因luc融合的重组报告质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3＇UTR-SV40]和pGL3.0[A3-luc-P25-3＇UTR-SV40]。以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,分别将构建的Bmo-miR-2755＊重组表达载体和2个重组报告质粒共转染BmN细胞,通过检测细胞中的荧光素酶活性,明确Bmo-miR-2755＊可显著下调BmFib-L基因的表达,并能上调BmP25基因的表达,但上调作用未达显著水平。上述结果为研究家蚕miRNA的功能和阐明蚕丝蛋白基因表达调控分子机制提供了新的实验数据。

人3p24-p25478kb完全基因组序列的注释

目的对我国承担的人类基因组测序项目中的3p24-p25478kb完全基因组序列进行注释。方法采用从头预测、数据库相似性比较和全长或部分mRNA序列与基因组序列的比对等手段,识别基因组序列中的编码蛋白质的基因,并采用EMBOSS软件包分析基因组序列的组分特征。结果识别出该区域中的两个编码蛋白质的已知基因,即SLC6A1和SLC6A11(其中后者在基因组草图序列中未被定位);对这段基因组序列中组分特征预测分析结果显示,该基因组序列的平均GC含量为47%,并存在3个假想的CpG岛,其中两个CpG岛分别位于130685～131516bp及307090～307870bp,另一个位于415585～416308bp。结论采用上述方法对基因组序列3p24-p25478kb进行了正确的注释,揭示了基因组序列中的有关的基因结构、GC含量、CpG岛等信息。

Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

【目的】探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,Bm FibL)和P25蛋白基因Bm P25表达的调控作用。【方法】分别以Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland)sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对Bm Fib-L和Bm P25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因Bm Fib-L和Bm P25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞Bm N中验证候选bmo-miRNAs对Bm Fib-L和Bm P25表达的调控作用。【结果】筛选到一个在Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*)。在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因Bm Fib-L和Bm P25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控Bm Fib-L和Bm P25表达的时空条件。miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm Fib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染Bm N细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm P25 3'UTR的luc表达载体共转染Bm N细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著。【结论】miR-375-3p显著下调Bm Fib-L基因的表达,而对Bm P25基因的表达无明显调控作用。

1型鸭疫里默氏杆菌p25蛋白基因(p25)的克隆表达及免疫学活性

为探讨1型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)p25蛋白的免疫原性,从RA1型基因组DNA中扩增出p25基因全长ORF,生物信息学分析显示其为含有完整保守结构域PRK00110的一未知功能保守蛋白。p25基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a(+)-p25。测序正确后,将重组表达质粒pET-32a(+)-p25转入E.coli Rosetta,并成功进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表明,表达的重组蛋白与预期大小一致,表达产物主要以可溶性形式存在;Western blotting检测显示,该蛋白具有良好的免疫原性。

四川省眉山市六个柑橘品种上衰退病毒分离株的组群构成、基因型及遗传特征

为有效利用弱毒株系交叉保护(mild strain cross protection,MSCP)防控柑橘衰退病,分别采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、双向逆转录-聚合酶链式反应(bi-directional reverse transcription polymerase chain reaction,BD-PCR)及多重分子标记对四川省眉山市6个柑橘品种30个样品上的柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)分离株进行组群构成、基因型、遗传特征和系统发育树分析。结果表明,在30个柑橘样品中,70.0%的样品为多种CTV组群混合侵染,且多为强毒和弱毒株系混合侵染;6个柑橘品种上CTV组群构成存在差异,温州蜜柑品种主要为组群1和组群3混合侵染,纽荷尔脐橙品种均为组群3和组群5混合侵染,其他4个品种主要为组群3和组群5混合侵染和组群3单一侵染。6个柑橘品种上CTV分离株均由3~5种基因型构成,构成较相似,均包括T3、T30、T36三种基因型,而不知火品种上未检出B165基因型。6个柑橘品种上CTV分离株的核苷酸序列相似性较高,介于92.4%~99.8%之间;遗传分化系数介于-0.114~0.467,基因流介于-35.89~52.92之间,其中纽荷尔脐橙CTV种群与除沃柑外其他品种的CTV种群的分化系数均大于0.281,基因流均小于1.00,表明这6个柑橘品种CTV种群之间存在基因交流,但纽荷尔脐橙CTV种群与其他品种交流不频繁;所有CTV分离株均被聚为3个不同的类群,其中春见、蜜柑、爱媛品种上大部分CTV分离株被聚为类群I,纽荷尔脐橙品种上所有CTV分离株被聚为类群II,而沃柑、不知火品种上大部分CTV分离株被聚为类群III;CTV种群间变异百分比为80.86%,表明寄主品种是CTV分离株p25基因遗传分化的重要因素。