禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的鉴定

为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴定,将目的蛋白截短成4段,初步鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,共筛选出4株单克隆细胞,其抗体亚类皆为IgG1型,其中3A1抗体效价为1∶64000,3B2为1∶256000,5F1为1∶128000,5G2为1∶8000;4株单克隆抗体识别的抗原表位在1-60 aa之间。研究结果为进一步建立ALV相关免疫学检测方法提供了重要的材料。

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

p27^(kipl)和p57^(kip2)与CyclinD1在急性白血病的表达及其临床意义

目的:探讨p27kipl和p57kip2与CyclinD1在急性白血病中的表达情况及其临床意义。方法:采用免疫组化S-P法检测39例急性白血病及10例正常对照者骨髓中p27kipl和p57kip2与CyclinD1蛋白的表达情况,并结合临床病理资料进行分析。结果:p27kipl和p57kip2与CyclinD1蛋白在急性白血病患者的阳性表达率分别为31%、33%、54%,在对照组表达率为70%、40%、0。p27kipl与cyclinD1在白血病与对照组中的表达差异有统计学意义。在37例接受化疗的急性白血病中,p27kipl和p57kip2阳性表达组化疗后的缓解率(66%、69%)明显高于p27kipl和p57kip2表达阴性组的缓解率(32%、29%),其差异有统计学意义(P<0.05)。p57kip2与CyclinD1在白血病中的表达具有正相关性。结论:p27kipl和p57kip2与CyclinD1在急性白血病患者中存在异常表达其蛋白的表达水平可能会影响化疗疗效。

白血病患者P27（Kipl）表达的初步研究

目的：研究白血病患者P27（Kipl)的表达及其与白血病预后的关系。方法：用蛋白印迹法（Western blot)加化学发光法研究23例急性白血病患者骨髓或外周血中白血病细胞的P27（Kipl)蛋白表达。结果：P27（Kipl)总阳性率为78．26％（18／23），但表达强度不一。急性非淋巴细胞白血病（ANLL）阳性率82．35％（14／17），4例急性淋巴细胞白血病（ALL）中2例阳性一，1例慢性粒细胞白血病急变期（CML－BC）为阳性，1例淋巴肉瘤白血病为阳性。P27（Kipl)低表达组与高表达组生存率无显著差异。13例已死亡的ANLL中P27（Kipl)高表达组总生存期长于低表达组（秩和检验P＝0．05）。所有进行化疗的18例患者达到完全缓解（CR）者P27（Kipl)平均表达强度高于未完全缓解（NR）者，但无统计学意义（秩和检验P＞0．05）。诊断时外周血白细胞数、血乳酸脱氢酶水平与P27（Kipl)无相关性。结论：P27（Kipl)的表达与ANLL的预后可能相关，高P27（Kipl)者预后好。

急性白血病p27kipl的表达及其意义

目的 探讨在白血病(AL)中p27kipl的表达情况及其临床意义。方法 用免疫组化SP法检测40 例AL中p27kipl的表达,并观察临床化疗效果。结果 ①40例AL中29例p27kipl阳性(73.3%),阳性部位以胞 核分布为主。在急性淋巴细胞白血病(ALL)的阳性率(72.5%)高于急性非淋巴细胞白血病(ANLL)(38.7%)。② p27kipl高表达的AL完全缓解率高,预后较好,p27kipl低表达或阴性者完全缓解率低,早期复发率高,预后差。③ p27kipl表达与白血病患者的性别、年龄、外周血白细胞数、FAB分型无明显相关性。结论 p27kipl表达高低与急 性白血病的完全缓解率密切相关,低表达者预后不良,是AL的一个独立预后指标。

急性白血病p27kipl、cyclinE及p21 wafl、p16的表达及其意义

目的 :探讨在急性白血病 (AL )中 p2 7kipl、cyclin E及 p2 7kipl、p16的表达情况及其临床意义。方法 :用免疫组化 SP法检测 39例 AL中 p2 7,cyclin E及 p2 1、p16的表达 ,并观察临床化疗效果。结果 :139例 AL中 p2 7,cyclin E,p2 1,p16阳性表达分别为 2 8例 (71.8% )、2 9例 (74.4% )、19例 (4 8.7% )、14例 (35 .9% ) ,阳性反应部位以胞核分布为主。2 p2 7与 cyclin E的表达呈显著正相关 (r=0 .83,P<0 .0 1) ,在 2 8例 p2 7过表达的 AL中有 2 2例 cyclin E表达亦增强 (78.6 % )。p2 7与其它两种蛋白 p16、p2 1之间表达无明显相关 (P>0 .0 5 )。3p2 7高表达伴或不伴随cyclin E过表达的 AL完全缓解率高 ,预后较好。反之 p2 7低表达或阴性者完全缓解率低 ,早期复发率高 ,预后差。结论 :p2 7及 cyclin E的协同表达异常对 AL的发生、发展有一定作用 ,是反映 AL复发难治 。

种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率的相关性研究

本研究旨在观察种鸡群所产种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与种鸡群发病状况及其下一代鸡群禽白血病发病率的相关性,为鸡群净化和禽白血病预警提供参考依据。对国内海兰褐蛋鸡等品系不同祖代及父母代共7个种鸡场所产种蛋的P27抗原进行了检测,对部分种鸡场的ALV-A/B和ALV-J抗体进行了检测和病毒的分离鉴定,对各种鸡群孵化后下一代鸡群的禽白血病发病状况和客户投诉情况进行了追踪调查。7个种鸡场所产种蛋中P27抗原检出率为0%～12%,P27抗原检出率与种鸡群的发病状况及其子代鸡群的发病状况和客户投诉情况密切相关,即种蛋中P27抗原检出率越高,种鸡群发病情况越严重,下游客户鸡群发病率和投诉率越高。种鸡群的种蛋P27检出率与种鸡群及其孵化后鸡群的禽白血病感染状况具有较好的吻合性,可以作为开展ALV的流行病学调查和禽白血病感染风险评估的重要指标。

禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白P27基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中提取RNA,通过RT＿PCR方法扩增出720bp的gagP27基因片段,克隆至pMD18＿T载体,酶切鉴定后进行序列测定和分析,表明该片段编码序列与国外RSV分离株(JO2342)的同源性达97 3%。将该片段亚克隆至pGEX＿6P＿1原核表达载体,转化受体菌BL＿21,经IPTG诱导表达,12%SDS＿PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明目的基因得到高效表达,所表达蛋白是大小为56kD的融合蛋白,占菌体总蛋白的23%。表达产物经GlutathionSpharose4B树脂亲和层析法纯化后,每100mL菌液最终可获得5mg重组P27蛋白,蛋白纯度在90%以上。用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Westernblot检测,表明重组P27蛋白有抗原反应活性。用纯化的重组P27蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组P27蛋白和多克隆抗体将为禽白血病的诊断及ELISA试剂盒的研制奠定基础。

急慢性白血病P27(Kip1)表达及其临床意义

为观察P2 7(Kip1)蛋白在常见白血病患者中的表达 ,探讨其与白血病类别、染色体异常、临床疗效和预后的关系 ,用蛋白印迹法加化学发光法对 82例初诊或复发白血病患者的骨髓或外周血进行P2 7(Kip1)蛋白的检测。结果显示 ,P2 7(Kip1)在急性淋巴细胞白血病 (ALL)中表达高于在急性非淋巴细胞白血病 (ANLL) (P =0 .0 33)和慢性粒细胞白血病 (CML) (P =0 .0 0 8)中表达。P2 7(Kip1)在慢性淋巴细胞白血病 (CLL)中表达高于在CML中表达 (P =0 .0 17)。P2 7(Kip1) >0 .6 5 5组首次化疗有效率 (CR和PR)高于P2 7(Kip1)≤ 0 .6 5 5组 ,两者有显著差异(P =0 .0 4 1)。急性白血病患者中 ,P2 7(Kip1) >0 .6 5 5组生存期长于P2 7(Kip1)≤ 0 .6 5 5组 ,P =0 .0 0 6 5 ;而且在ANLL(P =0 .0 2 71)、ALL(P =0 .0 2 6 6 )组中均有显著差异 ,P2 7(Kip1)表达高的 ,生存时间长 ,P2 7(Kip1)表达低的 ,生存时间短。P2 7(Kip1)表达低似乎与ALL患者多种染色体异常相关 (r =- 0 .775 ,P =0 0 4 )。而P2 7(Kip1)表达与白血病患者的性别、年龄、外周血白细胞数、原始细胞数、血LDH以及血尿酸水平无明显相关性。结论 :P2 7(Kip1)表达的高低与急性白血病的首次化疗效果、生存时间密切相关 ,低表达预示着不良预后。

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因绝对定量PCR方法的建立及应用

研究旨在建立一种检测禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p27(ALV-p27)基因实时荧光定量PCR的方法。通过设计ALV-p27特异性的荧光定量PCR引物扩增基因并制备质粒标准品,同时建立检测病毒衣壳蛋白p27基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法检测6日龄胚胎感染,1日龄出壳雏鸡不同组织中p27基因的分布和表达情况。结果表明,ALV-p27基因在1日龄雏鸡脑组织中表达水平最高,而在胸腺组织中表达水平最低。研究建立的检测ALV-p27基因绝对定量PCR方法为进一步研究其生物学功能提供了一种技术手段。

泄殖腔棉拭子检测禽白血病病毒p27抗原作为净化指标的评估

为了彻底消灭禽白血病病毒(ALV)感染,北京市华都峪口禽业有限责任公司在2009~2016年期间对京红和京粉两个蛋鸡品种原种鸡群的6个配套系开展了全面检测和净化,蛋清、胎粪和泄殖腔棉拭子样品ALV p27抗原检测及血浆病毒分离率数据表明,在实施净化前,部分配套系在蛋清、胎粪的ALV p27抗原检测及血浆病毒分离三项指标上都出现一定的阳性率,但随着净化的实施,这三项指标的阳性率迅速下降,并在最近5年稳定保持在零检出。在此期间,泄殖腔棉拭子p27阳性率仅从12.1%缓慢下降,维持在3.5%~5.4%。在其他三项指标已连续多年维持在零检出时,泄殖腔棉拭子p27的检测阳性率极大可能为假阳性。比较不同采样人员、采样部位、样品处理方法对ALV p27抗原检测的影响表明,不同人员采集的泄殖腔棉拭子样品p27抗原阳性检出率不稳定;不同部位采集的棉拭子样品p27抗原检出率不同,泄殖腔棉拭子样品p27抗原阳性率比阴道棉拭子样品高31%;样品的处理方式对检测结果也有不同程度的影响,如p27抗原的检出率随样品稀释液用量的增加而降低,冻融样品阳性率显著高于未冻融样品的阳性率。综合以上结果表明泄殖腔棉拭子ALV p27抗原检测不适合作为禽白血病净化的检测指标。

MicroRNA-221(miR-221)抑制p27^(Kip1)蛋白促进慢性粒细胞白血病的发生

目的探讨microRNA-221(miR-221)与慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leuklemia,CML)的相关性及其作用机制。方法采用荧光实时定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测35例CML病人与25例对照组病人骨髓中miR-221的表达情况。K562细胞转染miR-221模拟物和miR-221抑制剂48 h,qRT-PCR法检测miR-221的表达。分别用MTT法检测转染后的K562细胞增生能力,利用流式细胞仪检测转染后K562细胞周期和凋亡。利用数据库预测miR-221的调节基因为p27^(Kip1)。qRT-PCR和Western blotting法检测miR-221对p27^(Kip1)的mRNA和蛋白的表达的影响。结果 CML病人组miR-221表达明显高于对照组。转染miR-221抑制剂组K562细胞凋亡比例显著升高,细胞周期阻滞于G2SM期,细胞增生能力明显受到抑制。而miR-221过表达则明显促进了K562细胞的增生和细胞周期进程。抑制miR-221表达后K562细胞中p27^(Kip1)蛋白表达显著升高,而当miR-221过表达后p27^(Kip1)表达也随之明显降低。结论 miR-221在CML病人的骨髓中高表达,并抑制下游p27^(Kip1)蛋白的表达从而促进白血病K562细胞增生,促进细胞进入细胞周期,可能是CML发生、发展的一个潜在靶点。

P27^(kip1)与细胞周期蛋白G在急性白血病中的表达及相关性研究

为了探讨P27kip1与细胞周期蛋白G(cyclin G)在急性白血病患者中的表达及其相关性,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测89例急性白血病患者和10例正常人白细胞的P27kip1与cyclin G mRNA水平,采用Western blot检测39例急性白血病患者和10例正常人白细胞的P27kip1与cyclin G蛋白表达水平。结果显示:急性白血病初治/复发组的cyclin G mRNA与蛋白表达水平均明显高于缓解组和正常对照组(p<0.05或p<0.01);缓解组与正常对照组之间无显著差异(p>0.05)。急性白血病初治/复发组的P27kip1 mRNA水平与缓解组和正常对照组比较均无明显差异(p>0.05)。而急性白血病缓解组和正常对照组的P27kip1的蛋白表达水平高于初治/复发组(p<0.05),缓解组与正常对照组之间无显著差异(p>0.05)。P27kip1与cyclin G的表达呈低度负相关。结论:P27kip1与cyclinG在白血病患者中有异常表达,与白血病的发生发展有一定联系;P27kip1的低表达与cyclin G的异常高表达可能是白血病预后不良的因素之一。

同一母鸡三个蛋清混样检测禽白血病病毒p27抗原的可行性分析

为探讨采用母鸡3个蛋清混样开展禽白血病检测与净化的可行性,试验对2014~2016年北京油鸡5个品系30 639只母鸡蛋清禽白血病病毒p27抗原ELISA结果进行了统计与分析。同一母鸡3个蛋清S/P值求平均作为混样的S/P值,以S/P≥0.20、S/P≥0.15、S/P≥0.10为阳性判定标准,分别比较混样法与单独检测的一致性。结果显示:随着净化代次的增加,阳性判定阈值降低,混样法对阳性母鸡检出率逐渐升高。以S/P≥0.10为阳性标准,2016年阳性母鸡检出率为100%,母鸡阴性转为阳性的比例不超过1%,其中2个或3个蛋清S/P值≥0.10的占80%~90%。研究结果充分说明母鸡3个蛋清混样进行禽白血病病毒p27抗原检测理论上是可行的,尤其在净化后期或种群阳性比例不高的情况下,将S/P≥0.10定为阳性标准,不仅可以淘汰阳性个体,而且有助于淘汰弱阳性个体。

禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的禽白血病病毒p27重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过细胞培养和有限稀释法制备单克隆抗体,最终获得了3株能稳定分泌禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的细胞株2F3、5C2和5C7。经生物学特性分析,3株杂交瘤细胞染色体数均为90条左右,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光等方法对所获得的3株单克隆抗体进行了鉴定,证明3株单克隆抗体细胞株所分泌的抗体效价高,而且均能够和禽白血病病毒p27蛋白特异性发生反应。说明该3株单克隆抗体均具有与禽白血病病毒p27蛋白发生反应的反应原性。3株单克隆抗体的成功获得为禽白血病病毒抗原表位的分析,病毒的检测以及试剂盒的研发奠定了基础。

禽白血病/肉瘤病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其抗体的制备

采用细胞培养法增殖禽白血病/肉瘤病毒(ALV/RSV)A亚型,然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒,再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白。经检测,提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性。用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体,经ELISA方法检测其效价可达1∶6 400以上。

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。

抗禽白血病p27抗原单克隆抗体的制备与鉴定

检测p27抗原的检测试剂在禽白血病的研究和防治方面有着极其重要的作用。为研究国产的禽白血病诊断试剂,利用禽白血病各亚群病毒的p27蛋白很保守的特点,我们将原核表达的禽白血病p27蛋白作为抗原,免疫8周龄的BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得三株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过Western_blotting和ELISA的结果分析证明,三株单抗与原核表达得p27蛋白和禽白血病各亚群病毒反应,而不与禽流感病毒等反应。可以看出,这三株单抗在ALV的抗原分析、血清学诊断和疫苗质量监测以及禽白血病污染细胞检测等方面有着极其重要的应用价值。

B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株的TCID_(50)与p27抗原之间的相关性研究

为了研究B亚群禽白血病病毒(ALV-B)的半数细胞培养物感染量(TCID50)与p27抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)的S/P值之间的相关性,本试验将ALV-B SDAU09C2株接种鸡胚成纤维细胞(CEF细胞),换维持液后连续10d取样,检测10d的TCID50值与p27抗原的S/P值之间的相关性;同时,将该毒株在DF-1细胞系上传代至20代,取其中的第1、5、10、15和20代分别进行TCID50滴度的测定和p27抗原检测。结果表明,在CEF细胞上接种的ALV-B SDAU09C2株连续10d的TCID50值与p27抗原之间存在显著的正相关(r=0.94002;P<0.0001);在DF-1细胞系上传的不同代数之间也呈显著正相关(r=0.96449;P=0.0080)。由此可推测ALV-B的TCID50与p27抗原呈显著正相关,可以用ELISA法测得的p27抗原的S/P值来估测病毒的TCID50值。

禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备

将禽白血病病毒p27基因克隆并构建重组表达质粒pET28a-p27,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导后产生可溶性表达蛋白。表达的蛋白用Western blot进行活性检测,其能与辣根过氧化物酶标记的兔抗p27抗体发生特异性反应;采用金属螯和层析对表达蛋白进行纯化,其纯度约为95%;用纯化的表达蛋白p27免疫家兔制备抗血清,ELISA抗体效价可达1∶25600。研究结果表明,大肠杆菌表达的p27蛋白具有良好的抗原性,可以替代纯化病毒蛋白用于禽白血病病毒检测。