背根神经节嘌呤受体亚型P2X3R介导小鼠术后急—慢痛转化

目的探讨不同部位不同嘌呤受体亚型在小鼠切口术后痛转化中的作用差异。方法足底切口恢复后注射PGE_(2)构建术后痛转化模型。第一部分:C57BL/6小鼠随机分为对照(Con)组、假敏化(sHP)组、敏化(HP)组,检测机械痛阈、自发痛评分和焦虑样行为;Western blot检测患侧L 3-5背根神经节(DRG)和脊髓背角(SCDH)中P2X3R和P2X7R蛋白表达变化。第二部分:C57BL/6小鼠随机分为Con组、HP+生理盐水组、HP+P2X3R拮抗剂组或HP+P2X7R拮抗剂组,观察拮抗不同亚型嘌呤受体对小鼠机械痛阈的影响。结果与正常小鼠相比,切口痛小鼠注射PGE_(2)后机械痛阈明显下降,自发痛评分明显增加(P<0.05),未表现出焦虑样行为(P>0.05),且P2X3R蛋白在DRG中表达明显增多(P<0.05),在SCDH中未检出,而P2X7R蛋白在DRG和SCDH各组中表达均无差异(P>0.05)。拮抗P2X3R能阻断术后痛转化的产生,而拮抗P2X7R无明显影响。结论切口痛小鼠经PGE_(2)诱导可出现急慢性痛的转化,不伴发焦虑样情绪,DRG中P2X3R可能是参与术后痛转化的关键受体之一。

背根神经节P2X3R和TRPV1介导CFA致炎性痛大鼠不同时期痛行为

目的:动态检测完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的炎性痛大鼠健患侧足跖厚度、痛行为和背根神经节(dorsal ganglia root,DRG)中P2X3受体(purinergic P2X3 receptor,P2X3R)、辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)蛋白表达,探索炎性痛不同时期痛行为差异及其可能机制。方法:采用大鼠左侧足跖注射CFA建立炎性痛模型。将大鼠按随机数字表法分为对照组(control,Con group)和炎性痛组(CFA group)。分别检测基线(baseline,BL)和造模后1、3、7、14、28、42天时大鼠双侧足跖厚度、热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)和机械刺激缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT);Western bolt检测健(contralateral,Contra)患(ipsilateral,Ipsi)侧L_(4)-L_(6)DRG中P2X3R、TRPV1蛋白表达。结果:CFA大鼠患侧足跖厚度于造模后各时间点均显著高于Con-Ipsi组和CFA-Contra组。CFA大鼠患侧TWL仅于造模后1、3、7、14天时显著低于同期Con-Ipsi组,于造模后所有时间点均显著低于CFA-Contra组;CFA大鼠健侧TWL各时间点与Con-Contra相比均无差异。CFA大鼠患侧MWT于造模后所有时间点均显著低于同期Con-Ipsi组,于造模后1、3、7、14、28天时显著低于同期CFA-Contra组;与同期Con-Ipsi和Con-Contra组比,CFA大鼠健侧MWT于造模后28、42天时出现明显降低。CFA大鼠患侧DRG中P2X3R、TRPV1蛋白表达于造模后1、14、28、42天时均显著高于Con-Ipsi和Con-Contra组;CFA大鼠健侧DRG中P2X3R蛋白表达于造模后28、42天时显著多于Con-Contra组,而健侧DRG中TRPV1蛋白表达无差异。结论:CFA致炎性痛大鼠患侧足跖热痛觉过敏和机械痛觉异常持续存在,炎性痛后期可诱发出健侧足跖机械痛觉异常;P2X3R和TRPV1可能参与CFA大鼠早期和晚期外周痛敏化发生和维持,健侧背根神经节内P2X3R表达增加可能参与机械镜像痛的产生。

百事乐加味方对氧糖剥夺联合脂多糖诱导海马神经元细胞损伤的保护作用及机制研究

目的观察百事乐加味方对体外培养的海马神经元细胞的保护作用,探讨其治疗卒中后抑郁的作用机制。方法体外分离培养乳鼠海马神经元细胞,以氧糖剥夺联合脂多糖诱导海马神经元细胞损伤。将细胞分为正常组、模型组、空白血清组(10%)和百事乐加味方含药血清组(10%),倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况,ELISA检测细胞上清液神经递质谷氨酸(Glu)、5-羟色胺(5-HT)及促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量,免疫荧光染色检测嘌呤能P2X7受体(P2X7R)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)表达。结果与正常组比较,模型组海马神经元细胞形态发生明显变化,细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01),细胞上清液Glu、TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增加(P<0.05,P<0.01),5-HT含量显著减少(P<0.01),海马神经元P2X7R和NLRP3表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,百事乐加味方含药血清组海马神经元细胞形态明显改善,细胞存活率显著升高(P<0.01),细胞凋亡减少(P<0.01),细胞上清液Glu、TNF-α、IL-1β含量显著减少(P<0.05,P<0.01),5-HT含量显著增加(P<0.01),海马神经元P2X7R和NLRP3表达显著降低(P<0.01)。结论百事乐加味方可能通过抑制P2X7R/NLRP3信号通路、调节神经递质分泌、抑制炎症因子释放发挥对氧糖剥夺联合脂多糖诱导的海马神经元细胞炎症损伤的保护作用,从而治疗卒中后抑郁。

芦丁在BV2细胞中抗弓形虫的作用及机制分析

本研究旨在分析芦丁在BV2细胞中的体外抗弓形虫作用及其潜在机制。首先通过CCK8法、间接荧光染色法等测定芦丁的细胞毒性、弓形虫抑制率及增殖情况以探究芦丁在BV2细胞中的抗弓形虫作用;随后,将细胞分成4组,分别为:空白组(Normal)、感染对照组(T.gondii)、感染后低剂量芦丁治疗组(Rut 50)和感染后高剂量芦丁治疗组(Rut 100),进行弓形虫感染及芦丁处理试验,并用ELISA等方法检测细胞培养液上清液中抗氧化酶SOD、GSH及脂质氧化产物MDA水平,炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平,用Western blot检测BV2细胞中PI3K/AKT/Nrf2/HO-1、TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3信号通路中关键蛋白表达量。结果表明,在BV2细胞中,50和100μg·mL^(-1)的芦丁具有明显的抗虫效果,可显著抑制弓形虫感染率、入侵能力和增殖(P<0.05)。50和100μg·mL^(-1)的芦丁还可显著增多上清液中的SOD、GSH含量并降低MDA含量(P<0.05),且降低TNF-α、IL-6及IL-1β水平(P<0.05),并显著上调抗氧化通路PI3K/AKT/Nrf2/HO-1、下调炎症通路TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3中关键蛋白表达量(P<0.05)。结果提示,芦丁在BV2细胞中具有明显的抗弓形虫作用,这可能与其可以通过激活PI3K/AKT/Nrf2/HO-1通路从而增强细胞抗氧化能力、以及抑制TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3通路从而减弱炎症反应有关。研究结果可为后续探究芦丁体内抗虫效果及分析其对弓形虫性脑损伤保护机制相关研究提供一定的理论参考,并为将芦丁开发成治疗人畜弓形虫病的潜在药物提供科学依据。

加味四妙散对急性痛风性关节炎大鼠的疗效及对滑膜组织中嘌呤能离子通道型受体7 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3表达的影响

目的通过研究加味四妙散干预急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织中嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达的影响,探讨加味四妙散在防治急性痛风性关节炎的疗效及抗炎作用机制。方法选择雄性SD大鼠60只,按照随机数字表法分为6组,分别为空白对照组、模型组、秋水仙碱组、加味四妙散低剂量组、加味四妙散中剂量组、加味四妙散高剂量组,每组10只。空白对照组给予等体积0.9%氯化钠注射液在相应的部位,其余5组复制高尿酸血症并急性痛风性关节炎大鼠模型。加味四妙散组予加味四妙散低、中、高剂量水提液(4.24 g/kg、8.48 g/kg、16.96 g/kg)灌胃、秋水仙碱组予秋水仙碱混悬液(3 mg/kg)灌胃。模型组予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。经过4 h、8 h、12 h、24 h和48 h的治疗,对右踝关节的肿胀情况及大鼠步态进行观察。末次给药2 h后,通过腹主动脉采血,采用生化法检测血清尿酸浓度、肝肾功能及血清三磷酸腺苷(ATP)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-8含量,取受试踝关节滑膜组织,苏木精-伊红染色(HE)观察滑膜组织病理情况,利用蛋白免疫印迹法检测滑膜组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达。结果除空白对照组外,各组大鼠的踝关节肿胀率从造模后4~8 h开始上升,24 h达高峰后下降。在造模48 h后,秋水仙碱组和加味四妙散的低、中、高剂量组的肿胀率减轻,步态逐渐改善(P<0.05),与空白组比较,模型组中滑膜组织表现出关节炎病理改变,显微镜下可见滑膜脱落、坏死,滑膜细胞增生,相较于模型组,加味四妙散的低、中、高剂量组以及秋水仙碱组在血清ATP、IL-1β、血尿酸、IL-8均降低,滑膜组织关节炎病理情况得到改善。滑膜组织P2X7R、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),与秋水仙碱组相比,加味四妙散对大鼠肝肾功能的损害较小(P<0.05)。结论加味四妙散可以降低高尿酸血症和痛风模型大鼠的血尿酸水平,减少对肝肾功能的损害,抑制急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达,降低局部组织炎症反应,从而发挥治疗作用。

芒柄花黄素调控P2X7R/NLRP3通路对高糖诱导的心肌细胞炎症反应与焦亡的影响

目的探讨芒柄花黄素(FN)调控嘌呤能2X7受体(P2X7R)/核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3(NLRP3)通路对高糖诱导的心肌细胞的炎症反应与细胞焦亡的影响机制。方法将H9C2细胞分为对照组、高糖(HG)组、HG+FN低浓度(FN-L)组、HG+FN中浓度(FN-M)组、HG+FN高浓度(FN-H)组、HG+FN-H+P2X7R激活剂(ATP)组。24 h后,CCK-8检测H9C2细胞活力变化;TUNEL染色检测细胞焦亡变化;qRT-PCR检测焦亡因子白细胞介素(IL)-18、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-1)、NLRP3 mRNA表达水平;ELISA检测上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6和IL-1β水平;Western blot检测P2X7R、IL-18、Caspase-1、NLRP3蛋白表达水平。结果与对照组相比,HG组细胞活力显著下降(P<0.05),但焦亡率、LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β水平、P2X7R、IL-18、Caspase-1、NLRP3蛋白表达显著增加(P<0.05);与HG组相比,HG+FN-L组、HG+FN-M组、HG+FN-H组细胞活力显著增加(P<0.05),但焦亡率、LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β水平、P2X7R、IL-18、Caspase-1、NLRP3蛋白表达显著降低(P<0.05);与HG+FN-H组相比,HG+FN-H+ATP组细胞活力显著下降(P<0.05),但焦亡率、LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β水平、P2X7R、IL-18、Caspase-1、NLRP3蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论FN通过抑制P2X7R/NLRP3通路减轻高糖诱导的心肌细胞的炎症反应与细胞焦亡,缓解细胞损伤。

基于P2X7R/NLRP3通路探讨枳葛口服液改善大鼠酒精性肝损伤的作用机制

目的探讨枳葛口服液改善大鼠酒精性肝损伤的作用机制。方法60只大鼠随机分为正常组,模型组(白酒),枳葛口服液高、中、低剂量组(10、5、2.5 mL/kg),造模及给药12周后处死大鼠,计算肝脏指数,HE染色观察肝组织病理学改变,Western blot法检测肝组织P2X7R、NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达,免疫组织化学法检测肝组织NLRP3蛋白表达,ELISA法检测血清IL-6、IL-18、TNF-α、NF-κB水平。结果与模型组比较,枳葛口服液高剂量组大鼠肝脏指数降低(P<0.05),大鼠肝组织形态正常,基本无脂肪空泡及炎症细胞浸润,肝组织P2X7R、NLRP3、caspase-1、ASC、NLRP3蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),血清IL-6、IL-18、TNF-α、NF-κB水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论枳葛口服液可能通过降低P2X7R/NLRP3通路相关蛋白表达,减轻大鼠炎症因子产生,从而发挥改善酒精性肝损伤的作用。

夹脊电针对脊髓损伤大鼠P2X7R/NLRP3信号通路相关蛋白的影响

目的:观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠P2X7R/NLRP3信号通路NLRP3蛋白、NLRP3mRNA及NLRP3/OX42的共定位表达的影响,为夹脊电针在临床中治疗脊髓损伤提供实验理论依据。方法:将120只SD大鼠随机分为5组,即假手术组、模型组、夹脊电针组、P2X7R干扰组和干扰对照组,每组根据不同时间点分为1 d、3 d、7 d和21 d共4个亚组,每个亚组6只,假手术组仅暴露大鼠脊髓,模型组采用改良Allen’s打击法制备SCI大鼠模型,夹脊电针组于模型组基础上给予夹脊电针治疗,P2X7R干扰组于模型制备基础上注射P2X7RsiRNA干扰病毒,干扰对照组注射阴性对照病毒,选取BBB评分1~3分者纳入本实验。各组大鼠在相应时间治疗后再次进行BBB评分,然后处死并取材。用Western blot法检测NLRP3蛋白的表达,用Realtime-PCR检测各组大鼠脊髓组织NLRP3 mRNA的表达,用免疫荧光双染法观察NLRP3与OX42共定位表达。结果:BBB评分结果显示,各时间点模型组BBB评分较假手术组显著降低(P<0.05),夹脊电针治疗后BBB评分明显升高(P<0.05);术后3 d、7 d和21 d,假手术组、夹脊电针组和P2X7R干扰组NLRP3蛋白表达量均低于模型组(P<0.05),干扰对照组NLRP3蛋白表达量高于P2X7R干扰组(P<0.05);各时间点模型组NLRP3 mRNA较假手术组均升高显著(P<0.05),夹脊电针治疗后在7 d、21 d时NLRP3 mRNA表达水平明显低于模型组(P<0.05),在3 d、7 d和21 d时,P2X7R干扰组NLRP3 mRNA表达水平低于干扰对照组和模型组(P<0.05);术后各时间点模型组NLRP3与OX42共定位阳性表达较假手术组明显增多,3 d、7 d和21 d时夹脊电针组NLRP3与OX42共定位阳性表达明显低于模型组。结论:夹脊电针能降低脊髓损伤大鼠NLRP3蛋白、NLRP3 mRNA及NLRP3/OX42的共定位表达,减轻脊髓损伤大鼠炎症反应,改善脊髓损伤大鼠运动功能。

P2X3受体对大鼠海马CA1区锥体神经元兴奋性的影响

目的:研究P2X3受体(P2X3 receptor,P2X3R)在海马CA1区的定位及对CA1区锥体细胞兴奋性的影响。方法:免疫荧光技术对P2X3R在海马CA1区表达进行定位,SD鼠麻醉后断头取脑,修块后应用振动切片机切出350μm脑片并用正常人工脑脊液26℃恒温孵育1 h,通过膜片钳全细胞记录技术,给予P2X3R选择性拮抗剂AF-353和非选择性激动剂α,β-Me ATP干预,记录锥体细胞动作电位发放频率的改变。结果:P2X3R在海马区主要表达于神经元上,在星形胶质细胞不表达。P2X3R拮抗剂AF-353减慢锥体细胞动作电位发放频率减小其兴奋性[(0.788±0.163)Hz vs.(0.352±0.079)Hz,t=7.32,P=0.002],α,β-Me ATP则加快动作电位发放频率[(0.715±0.186)Hz vs.(1.610±0.454)Hz,t=-4.97,P=0.008],增加兴奋性。结论 :P2X3R在海马区主要表达于神经元树突及胞质并且影响神经元兴奋性,可能参与了兴奋性增高有关疾病的发生发展过程。

四甲基哌啶氮氧自由基介导P2X4R/NLRP3信号通路改善七氟醚诱导老龄小鼠认知功能障碍

目的 探究四甲基哌啶氮氧自由基(TEMPO)对七氟醚诱导的老龄小鼠认知功能障碍的影响及机制。方法 将50只12月龄C57BL/6老年小鼠随机分为对照组、七氟醚组、TEMPO低、中和高剂量组,每组10只。Morris水迷宫实验检测小鼠学习和记忆能力;HE染色观察小鼠海马组织病理改变;TUNEL实验检测小鼠海马组织细胞凋亡;免疫荧光检测小鼠海马组织小胶质细胞标志物Iba-1;ELISA实验检测小鼠海马组织炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达;Western blot检测小鼠海马组织P2X4R和NLRP3蛋白表达水平。结果 给予TEMPO降低七氟醚诱麻醉的老龄小鼠逃避潜伏期,增加小鼠目标象限停留时间和穿越平台次数,改善小鼠海马组织病理损伤,降低小鼠海马组织细胞凋亡和小胶质细胞激活,下调小鼠海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平及P2X4R和NLRP3蛋白表达水平。结论 TEMPO通过抑制P2X4R/NLRP3通路改善七氟醚麻醉诱导的老年小鼠海马组织病理损伤、神经细胞凋亡和神经炎症,改善小鼠认知功能障碍。

清热通络方对痛风性关节炎大鼠P2X7R/NALP3/IL-1β信号通路的影响

目的:研究清热通络方通过P2X7R/NALP3/IL-1β炎症信号通路干预痛风性关节炎(GA)大鼠的作用机制。方法:60只雄性SD大鼠随机分为空白对照组,模型组,秋水仙碱组,清热通络方低、中、高剂量组(1.63、8.14、16.3 g·kg^(-1)·d~(-1))。除空白对照组、模型组外,各组大鼠预灌胃给药4 d。除空白对照组外,第4天灌胃后复制GA模型,造模后各时间段(4、6、12、24、48、72 h)检测大鼠踝关节肿胀率和热痛阈。给药7 d后取材,HE染色观察踝关节滑膜病理情况,生化法检测血清ATP水平,ELISA法测血清白细胞介素(IL)-8、IL-37、IL-1β水平,免疫组化法测滑膜组织P2X7R、NF-κB(P50、P65)、NALP3、IL-1β蛋白表达,RT-qPCR检测PBMCs P2X7R、IL-1β mRNA表达,Western Blot检测PBMCs P2X7R、IL-1β蛋白表达。结果:造模后4 h,各组大鼠踝关节肿胀率升高,24 h达高峰后下降;热痛阈下降,24 h达最低后上升。造模72 h后,与模型组比较,秋水仙碱组和清热通络方高剂量组肿胀率和热痛阈显著改善(P<0.05)。秋水仙碱及清热通络方各剂量组踝关节滑膜细胞炎症均有所改善;秋水仙碱组和清热通络方高剂量组血清ATP、IL-8、IL-37、IL-1β水平,PBMCs中P2X7R、IL-1β蛋白及mRNA表达,滑膜组织P2X7R、NALP3、NF-κB(P50、P65)、IL-1β蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论:清热通络方可能通过抑制GA大鼠P2X7R/NALP3/IL-1β信号通路缓解炎症,发挥治疗作用。