永生化小鼠小胶质细胞P_2X_4siRNA靶点的筛选

目的筛选永生化小鼠小胶质细胞特异性P2X4siRNA。方法转染FAM-siRNA16h后,激光扫描共聚焦显微镜检测永生化小鼠小胶质细胞转染效率;将3条特异性siRNA经lipofectamine2000介导转染永生化小鼠小胶质细胞;72h后半定量RT-PCR观察干扰前后P2X4基因mRNA水平表达,比较对应不同位点的三对siRNA片段对P2X4基因的干扰效果,分析RNA干扰的特异性,从中筛选出特异性最高的一条siRNA;转染该序列72h后Western blot检测P2X4基因蛋白表达。结果激光扫描共聚焦显微镜显示转染效率达80%;三对siRNA片段中siRNA-F1的沉默效率最高,最大干扰效率达72.2%;Western blot显示转染siRNA-F1后P2X4基因蛋白表达下调。结论siRNA-F1可有效下调永生化小鼠小胶质细胞中P2X4基因mRNA表达水平,并且能明显下调P2X4蛋白表达。

尼罗罗非鱼P2X4R基因克隆及原核表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼P2X4R基因,并构建原核表达载体进行诱导表达,为深入研究P2X4R在鱼类中的生物学功能打下基础。【方法】利用PCR克隆尼罗罗非鱼P2X4R基因的3个片段(G1、G2和G3),拼接获得目的基因后连接pCold Ⅱ载体构建pCold Ⅱ-P2X4R重组质粒,再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达。分别采用SDS-PAGE和Western blotting检测分析重组蛋白P2X4R的表达情况,并运用生物信息学在线分析软件对其理化性质、糖基化位点、跨膜区域、亚细胞定位及信号肽等进行预测分析。【结果】克隆获得的尼罗罗非鱼P2X4R基因大小为1108 bp,与pCold Ⅱ载体重组后转化BL21(DE3)感受态细胞获得的原核表达载体经IPTG诱导可表达获得目的蛋白,在IPTG 1.0 mmol/L、37℃诱导4 h的条件下重组蛋白表达量高于在IPTG 0.1 mmol/L、16℃过夜诱导的表达量。重组蛋白P2X4R的分子量约43.0 k D,其氨基酸数量为354个,理论等电点(pI)为6.78,不稳定指数为37.62,属于稳定蛋白,脂肪族指数为74.35;重组蛋白P2X4R具有3个N-糖基化位点和1个O-糖基位点;该蛋白未见跨膜区,其蛋白几乎100%位于细胞膜内,不含信号肽。【结论】诱导表达获得的尼罗罗非鱼P2X4R蛋白具有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点,推测其存在糖基化现象,可制备相应抗体用于揭示罗非鱼巨噬细胞的抗原呈递作用机制。