miR-216a对重症急性胰腺炎腺泡损伤及P2X7-NLRP3/caspase-1 通路的影响

目的探索miR-216a对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)腺泡细胞损伤及P2X7-NLRP3/caspase-1通路的影响.方法将大鼠胰腺腺泡细胞AR42J分为Con组、SAP组、anti-miR-NC组、anti-miR-216a组、Sch+miR-NC组、Sch+miR-216a组.Con组不做任何处理,其余各组采用雨蛙肽(10 nmol/L)联合脂多糖(lipo poly saccharide,LPS)(10 mg/L)处理大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J构建SAP细胞模型,anti-miR-NC组、anti-miR-216a组、Sch+miR-NC组、Sch+miR-216a组分别转染anti-miR-NC、anti-miR-216a、miR-NC、miR-216a mimics.酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组细胞培养液上清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)浓度;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测各组细胞中miR-216a及P2X7、NLRP3、caspase-1 mRNA相对表达量;Western blot法检测各组细胞中P2X7、NLRP3、Caspase-1、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific protease-3,Cleaved caspase-3)蛋白表达情况.结果各组细胞中IL-6、TNF-α含量比较,Con组<anti-miR-216a组<SAP组/anti-miR-NC组/Sch+miR-NC组<Sch+miR-216a组,差异有统计学意义(P<0.05).各组细胞凋亡率和Bax蛋白、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量比较,Con组<Sch+miR-216a组<SAP组/anti-miR-NC组/Sch+miR-NC组<anti-miR-216a组,差异有统计学意义(P<0.05);各组细胞Bcl-2蛋白相对表达量比较,anti-miR-216a组<SAP组/anti-miR-NC组/Sch+miR-NC组<Sch+miR-216a组<Con组,差异有统计学意义(P<0.05).各组细胞中miR-216a和P2X7、NLRP3、Caspase-1 mRNA及其蛋白相对表达量比较,Con组<anti-miR-216a组<SAP组/anti-miR-NC组/Sch+miR-NC组<Sch+miR-216a组,差异有统计学意义(P<0.05).结论miR-216a可通过抑制P2X7-NLRP3/caspase-1信号通路减轻SAP腺泡细胞炎症,并诱导细胞凋亡,从而减轻SAP腺泡损伤.

小胶质细胞P2X7-NLRP3/caspase-1通路在脉络膜新生血管中的作用机制

目的:探讨视网膜小胶质细胞通过P2X7-NLRP3/caspase-1炎症小体通路介导的在脉络膜新生血管(CNV)发生中的作用机制。方法:40只C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组和CNV激光模型组。实验各组于激光照射后第4天取材,应用眼底荧光素血管造影(FFA)和光相干断层扫描(OCT)一体机观察激光照射处CNV是否形成;应用免疫荧光检测视网膜冰冻切片P2X7和NLRP3/Caspase-1炎症小体和IL-1β的表达情况;分别运用Western Blot和实时荧光定量PCR检测CD11b、P2X7、NLRP3炎症小体、caspase-1和IL-1β蛋白含量表达和mRNA含量的表达情况。结果:FFA检查显示,CNV模型组激光斑处早期呈现强荧光改变,晚期荧光素渗漏增强,表明CNV生成;正常对照组无明显荧光素渗漏。视网膜组织免疫荧光显示,激光斑处小胶质细胞胞体增大,呈阿米巴状;激光诱导损伤的第4天,激光斑处可见P2X7、NLRP3炎症小体、caspase-1和IL-1β抗体所标记的阳性细胞聚集。与正常对照组相比,应用Western Blot和实时荧光定量PCR所检测激光诱发CNV模型组CD11b、P2X7、NLRP3炎症小体、Caspase-1和IL-1β的蛋白含量和mRNA含量均明显上升(P<0.05)。结论:初步揭示了在CNV发生过程中,视网膜小胶质细胞通过P2X7-NLRP3/caspase-1炎症小体通路的作用机制。

P2X7R/NLRP3/Caspase-1通路在难治性癫痫患者外周血中的表达

目的探讨P2X7R/NLRP3/Caspase-1通路在难治性癫痫患者外周血中的表达。方法选取2021年7月至2022年4月在郑州大学附属洛阳中心医院就诊的难治性癫痫患者40例作为癫痫组,分别留取患者癫痫发作期(ES)和癫痫发作间期(EI)的外周血;纳入同期的健康体检者40例作为正常对照组。应用流式细胞仪检测各组P2X7R表达水平,应用ELISA试剂盒检测血浆中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平。结果癫痫组P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、红细胞沉降率(ESR)及血清C-反应蛋白(CRP)的表达水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。癫痫组ES的外周血中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、ESR及CRP的表达均高于EI及正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且EI时P2X7R、NLRP3、Caspase-1及炎症因子(IL-1β和IL-18)在外周血中的表达仍高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论P2X7R/NLRP3/Caspase-1信号通路可能参与了癫痫急性和慢性发生中炎症相关的神经损伤,此可能为难治性癫痫的治疗提供新的靶点。

嘌呤配体P2X门控离子通道型受体7及其下游分子在痛风性关节炎中作用机制的研究进展

目前随着痛风性关节炎的发病率逐年上升,对该病炎性反应及疼痛机制的研究越来越多,该病主要由尿酸盐沉积及ATP刺激P2X7R、Nod样受体蛋白3、NEK7表达诱导炎性反应递质成熟与分泌所致,但具体机制尚不明确。现对P2X7R、NLRP3、NEK7的国内外研究进展进行综述,以探讨GA炎性反应及疼痛的发病机制,为防治GA提供新思路与治疗靶点。

清热通络方对痛风性关节炎大鼠P2X7R/NALP3/IL-1β信号通路的影响

目的:研究清热通络方通过P2X7R/NALP3/IL-1β炎症信号通路干预痛风性关节炎(GA)大鼠的作用机制。方法:60只雄性SD大鼠随机分为空白对照组,模型组,秋水仙碱组,清热通络方低、中、高剂量组(1.63、8.14、16.3 g·kg^(-1)·d~(-1))。除空白对照组、模型组外,各组大鼠预灌胃给药4 d。除空白对照组外,第4天灌胃后复制GA模型,造模后各时间段(4、6、12、24、48、72 h)检测大鼠踝关节肿胀率和热痛阈。给药7 d后取材,HE染色观察踝关节滑膜病理情况,生化法检测血清ATP水平,ELISA法测血清白细胞介素(IL)-8、IL-37、IL-1β水平,免疫组化法测滑膜组织P2X7R、NF-κB(P50、P65)、NALP3、IL-1β蛋白表达,RT-qPCR检测PBMCs P2X7R、IL-1β mRNA表达,Western Blot检测PBMCs P2X7R、IL-1β蛋白表达。结果:造模后4 h,各组大鼠踝关节肿胀率升高,24 h达高峰后下降;热痛阈下降,24 h达最低后上升。造模72 h后,与模型组比较,秋水仙碱组和清热通络方高剂量组肿胀率和热痛阈显著改善(P<0.05)。秋水仙碱及清热通络方各剂量组踝关节滑膜细胞炎症均有所改善;秋水仙碱组和清热通络方高剂量组血清ATP、IL-8、IL-37、IL-1β水平,PBMCs中P2X7R、IL-1β蛋白及mRNA表达,滑膜组织P2X7R、NALP3、NF-κB(P50、P65)、IL-1β蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论:清热通络方可能通过抑制GA大鼠P2X7R/NALP3/IL-1β信号通路缓解炎症,发挥治疗作用。

P2X7受体阻断对碘酸钠诱导的年龄相关性黄斑变性小鼠NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的探讨P2X7受体阻断剂亮蓝G(BBG)对碘酸钠(NaIO3)诱导的年龄相关性黄斑变性(AMD)小鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)通路的影响。方法C57BL/6SPF级雄性小鼠随机分为对照组、模型组、BBG(低、中、高)剂量组,每组12只,除对照组外其余各组25μg/g尾静脉注射NaIO3诱导建立AMD模型。BBG(低、中、高)剂量组分别腹腔注射25、50、100μg/(g·d)BBG溶液;对照组、模型组腹腔注射等体积生理盐水,连续注射7 d。苏木精-伊红染色(HE)染色视网膜组织,光学相关断层扫描(OCT)检测小鼠眼底情况,以距视神经450 mm处的视网膜厚度进行定量分析;记录视网膜电图,并用LabView7编译程序分析a波、b波;实时荧光定量PCR检测小鼠视网膜中P2X7R m RNA水平;蛋白免疫印迹法检测小鼠视网膜组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1、白介素-1β(IL-1β)蛋白水平。结果与对照组比较,模型组视网膜厚度变薄、a波和b波降低,差异有统计学意义(P<0.05);模型组组织中P2X7R m RNA、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,BBG(低、中、高)剂量组视网膜厚度增加、a波和b波升高,差异有统计学意义(P<0.05);BBG低剂量组组织中P2X7R mRNA、NLRP3、caspase-1,BBG(中、高)剂量组组织中P2X7R mRNA、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着BBG剂量增加,视网膜厚度逐渐增加、a波和b波逐渐升高;组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白水平逐渐降低,呈剂量依赖性。结论P2X7R阻断可抑制视网膜组织中NLRP3/caspase-1通路,促进视网膜结构恢复。

利多卡因对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的影响及机制

目的探讨利多卡因对急性肺损伤(ALI)大鼠的作用及ATP门控的嘌呤能P2X7受体(P2X7R)/NLRP3/Caspase-1信号通路的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分成生理盐水对照组(NS组)、脂多糖(LPS)模型组(LPS组)、5 mg/kg利多卡因治疗组(5LD组)、10 mg/kg利多卡因治疗组(10LD组)、20 mg/kg利多卡因治疗组(20LD组),每组8只。腹腔注射5 mg/kg LPS建立大鼠ALI模型,以LPS组中LPS给药时间为基点,5LD组、10LD组、20LD组分别于LPS注射前10 min、LPS注射后1 h、LPS注射后3 h时腹腔注射相应剂量1%利多卡因,LPS组在这三个时间点给予等量生理盐水,NS组四个时间点给予等量的生理盐水。建模24 h后,腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉各组大鼠,取同一部位肺组织测算肺湿干重比值(W/D),采用HE染色法观察肺组织病理学变化,采用Western blotting法检测P2X7R、NLRP3、Casepase-1蛋白表达,采用检测ELISA法肺组织IL-1β、HMGB1水平,采用比色法检测肺组织MPO含量。结果NS组肺组织结构完整,LPS组肺组织结构明显受损,20LD组肺泡结构基本完整,肺泡间隔水肿、炎症细胞浸润、出血均明显减轻。LPS组W/D高于NS组,10LD组、20LD组W/D均低于LPS组(P均<0.01)。LPS组P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表达均高于NS组(P均<0.01);10LD组P2X7R、NLRP3蛋白表达均低于LPS组(P均<0.05);20LD组P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表达均低于LPS组(P均<0.05)。LPS组IL-1β、HMGB1、MPO水平均高于NS组(P<0.01);5LD组、10LD组、20LD组IL-1β、HMGB1、MPO水平均低于LPS组(P<0.05或0.01)。结论利多卡因可以改善ALI大鼠的肺组织病理损伤程度,减轻肺水肿程度,降低肺组织IL-1β、HMGB1表达及MPO活力,其机制可能与抑制P2X7R/NLRP3/Caspase-1信号通路有关。

细胞焦亡非经典途径蛋白质在皮肌炎/多发性肌炎患者肌肉组织中的表达及意义

目的检测caspase-4、caspase-5、gasdermin D(GSDMD)、核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体蛋白质3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、泛连接蛋白质1(Pannexin-1)及P2X7在皮肌炎(dermatomyositis,DM)和多发性肌炎(polymyositis,PM)患者肌肉组织中的表达水平,研究探讨细胞焦亡非经典途径蛋白质在DM和PM发病机制中的作用及意义。方法选取2019年1月—2020年9月在我院就诊的DM患者13例,PM患者9例及因单纯骨科创伤行清创术的无其他伴随疾病的志愿者20例。采用HE染色检测各组肌肉组织的病理改变,并采用免疫组织化学法检测各组肌肉组织中caspase-4、caspase-5、GSDMD、NLRP3、Pannexin-1和P2X7的表达水平。结果(1)HE染色显示对照组肌肉组织肌纤维形态结构基本正常,未见明显炎性细胞浸润及萎缩、变性、坏死;DM组和PM组肌纤维大小不一、粗细不等,有大量炎性细胞浸润,可见不同程度的萎缩、变性、坏死;DM组和PM组患者肌肉组织HE染色病理学评分显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);(2)免疫组织化学染色显示caspase-4、caspase-5、GSDMD、NLRP3、Pannexin-1及P2X7在DM组和PM组肌肉组织中的表达均高于对照组(P<0.05);(3)Pearson相关分析提示DM组和PM组肌肉组织HE染色病理学评分和caspase-4、caspase-5、GSDMD、NLRP3、Pannexin-1以及P2X7的免疫组化评分均呈正相关(P<0.05);caspase-4、caspase-5的免疫组化评分与GSDMD和Pannexin-1的免疫组化评分均成正相关(P<0.05);GSDMD与NLRP3的免疫组化评分均成正相关(P<0.05);Pannexin-1与P2X7的免疫组化评分均成正相关(P<0.05)。结论细胞焦亡非经典途径蛋白质可能参与了DM和PM的发病过程,并且可能是通过促进炎症反应来参与其发病,提示在DM和PM的免疫发病机制中非经典途径的细胞焦亡起着至关重要作用。