基于生物信息学的人P2X7R结构分析及功能预测

目的:利用生物信息学分析人嘌呤能离子通道型受体7(purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor,P2X7R)蛋白结构特征,同时对不同物种的P2X7R蛋白同源性、蛋白质间的相互作用、细胞抗原表位进行预测,为相关疾病诊断与治疗提供理论依据。方法:登录ProtParam、TMHMM、ProtScale及SignalP 5.0 Server等软件对人P2X7R蛋白进行分析预测。结果:人P2X7R蛋白由595个氨基酸组成,分子式为C_(3077) H_(4749) N_(835) O_(871) S_(40,)理论等电点PI为8.62,不稳定系数46.07,总平均亲水性为−0.317;该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽同时存在跨膜区,属于跨膜蛋白;二级结构中存在157个α-螺旋,288个无规卷曲,分别占所有氨基酸比例26.39%、48.40%,三级结构预测结果的覆盖率为100%,序列相似度为80.34%,同时拉曼图结果分析该预测结构较为稳定;蛋白相互作用结果显示,存在多种与人P2X7R蛋白相互作用的蛋白,且P2X7R与炎症发生密切相关;该蛋白存在多个B、T细胞抗原表位,可为疫苗的研制提供思路。结论:基于生物信息学方法得到的人P2X7R蛋白分析具有一定可靠性,P2X7R参与炎症疾病的发生发展,通过预测筛选出的B、Th、CTL细胞抗原表位将为疾病的治疗提供方案。

加味四妙散对急性痛风性关节炎大鼠的疗效及对滑膜组织中嘌呤能离子通道型受体7 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3表达的影响

目的通过研究加味四妙散干预急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织中嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达的影响,探讨加味四妙散在防治急性痛风性关节炎的疗效及抗炎作用机制。方法选择雄性SD大鼠60只,按照随机数字表法分为6组,分别为空白对照组、模型组、秋水仙碱组、加味四妙散低剂量组、加味四妙散中剂量组、加味四妙散高剂量组,每组10只。空白对照组给予等体积0.9%氯化钠注射液在相应的部位,其余5组复制高尿酸血症并急性痛风性关节炎大鼠模型。加味四妙散组予加味四妙散低、中、高剂量水提液(4.24 g/kg、8.48 g/kg、16.96 g/kg)灌胃、秋水仙碱组予秋水仙碱混悬液(3 mg/kg)灌胃。模型组予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。经过4 h、8 h、12 h、24 h和48 h的治疗,对右踝关节的肿胀情况及大鼠步态进行观察。末次给药2 h后,通过腹主动脉采血,采用生化法检测血清尿酸浓度、肝肾功能及血清三磷酸腺苷(ATP)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-8含量,取受试踝关节滑膜组织,苏木精-伊红染色(HE)观察滑膜组织病理情况,利用蛋白免疫印迹法检测滑膜组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达。结果除空白对照组外,各组大鼠的踝关节肿胀率从造模后4~8 h开始上升,24 h达高峰后下降。在造模48 h后,秋水仙碱组和加味四妙散的低、中、高剂量组的肿胀率减轻,步态逐渐改善(P<0.05),与空白组比较,模型组中滑膜组织表现出关节炎病理改变,显微镜下可见滑膜脱落、坏死,滑膜细胞增生,相较于模型组,加味四妙散的低、中、高剂量组以及秋水仙碱组在血清ATP、IL-1β、血尿酸、IL-8均降低,滑膜组织关节炎病理情况得到改善。滑膜组织P2X7R、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),与秋水仙碱组相比,加味四妙散对大鼠肝肾功能的损害较小(P<0.05)。结论加味四妙散可以降低高尿酸血症和痛风模型大鼠的血尿酸水平,减少对肝肾功能的损害,抑制急性痛风性关节炎大鼠踝关节滑膜组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达,降低局部组织炎症反应,从而发挥治疗作用。

P2X7受体蛋白在胰腺癌中的表达及其对侵袭迁移影响的实验研究

目的:探讨P2X7受体蛋白在胰腺癌中的表达及其与临床病理之间的关系,探讨P2X7受体蛋白表达对胰腺癌侵袭迁移的影响及机制。方法:免疫组织化学法分析人胰腺癌组织及癌旁组织中P2X7受体蛋白的表达情况,分析其与胰腺癌临床病理特点之间的关系;选取胰腺癌细胞系PANC-1细胞,分别经P2X7受体激动剂Bz ATP(200μmol/L)及抑制剂A740003(20μmol/L)处理后,Transwell实验、细胞划痕实验检测PANC-1的侵袭迁移能力变化,Western blot实验检测侵袭及迁移相关蛋白MMP2、MMP9的表达变化。结果:P2X7受体蛋白在胰腺癌组织中高表达,在癌旁组织中低表达;且P2X7受体蛋白表达水平与胰腺癌的临床肿瘤分化程度及淋巴结转移呈显著性相关(P<0.05)。P2X7受体蛋白可通过上调MMP2、MMP9蛋白的表达促进胰腺癌细胞的侵袭迁移。结论:P2X7受体蛋白在胰腺癌中高表达并参与调控胰腺癌的侵袭及迁移,可能成为胰腺癌治疗的潜在分子靶点。

胆固醇敏感器SCAP功能失调通过上调P2X7受体表达促进THP-1源性巨噬细胞炎症小体活化

目的探讨胆固醇调节原件结合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)功能失调促进THP-1源性巨噬细胞炎症小体活化及IL-1β成熟的分子机制。方法采用基因转染方法在THP-1源性巨噬细胞中过表达SCAP,结合使用P2X7受体(P2X7 receptor,P2X7R)激动剂ATP(5 mmol/L)或抑制剂A438079(100μmol/L)处理THP-1源性巨噬细胞,将细胞分为:(1)对照组、(2)ATP处理组、(3)A438079处理组、(4)ATP+A438079组、(5)过表达SCAP组、(6)过表达SCAP+ATP组、(7)过表达SCAP+A438079组、(8)过表达SCAP+ATP+A438079组。RTPCR检测过表达SCAP以及激动或抑制P2X7R对P2X7R、pro-IL-1β、NLRP3、pro-caspase-1基因表达水平的影响。流式细胞术检测细胞表面P2X7R的表达。Western blot检测SCAP、pro-IL-1β、NLRP3、caspase-1(p20)以及培养上清中IL-1β的蛋白水平。同一实验在细胞水平重复4次。结果 (1)过表达SCAP组与对照组比较,其pro-IL-1β、P2X7R基因表达水平显著升高(P<0.01),细胞表面P2X7R表达明显上调。(2)P2X7R激动剂ATP与抑制剂A438079对THP-1源性巨噬细胞SCAP及P2X7R m RNA表达无影响(P>0.05)。P2X7R激动剂ATP能够显著促进THP-1源性巨噬细胞pro-IL-1βm RNA表达(P<0.05),在过表达SCAP基础上激动P2X7R能够进一步激活pro-IL-1β基因转录(P<0.01),同时显著促进细胞内pro-IL-1β剪切成熟并向细胞外分泌(P<0.01),抑制P2X7R活性并不影响过表达SCAP致pro-IL-1β表达上调的作用,但将减少上清中成熟IL-1β的含量。过表达SCAP并不影响NLRP3及caspase-1表达(P>0.05),但在过表达SCAP基础上充分激动P2X7R将显著上调NLRP3及caspase-1基因及蛋白水平(P<0.01),上述变化能够被P2X7R抑制剂A438079抵消。结论胆固醇敏感器SCAP功能失调能够促进THP-1源性巨噬细胞内pro-IL-1β表达,同时通过上调细胞表面P2X7R表达激活NLRP3炎症小体,促进pro-IL-1β成熟及其向细胞外分泌。

P2X7受体胞外段蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:克隆嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)胞外段编码序列,体外表达和鉴定重组P2X7R胞外段蛋白。方法:采用德泰生物密码子优化软件MaxCodon^TM Optimization Program(V13),对P2X7R胞外段蛋白氨基酸编码序列进行优化并设计PCR扩增引物。采用重叠PCR扩增目标基因,通过限制性酶切位点NdeⅠ和HindⅢ,将P2X7R胞外段编码序列定向插入原核表达载体pET30a(+),构建pET30a-P2X7R重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+)表达菌种中,进行融合表达,诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。重组蛋白含6×His纯化标签,亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化后,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot鉴定纯化产物。结果:PCR扩增的P2X7R胞外段蛋白编码序列长度为885 bp,成功构建重组pET30a-P2X7R质粒,并转化至E.coli BL21(DE3+)菌株中。融合型表达的重组蛋白分子量约为34 kD,可被抗His标签单克隆抗体特异性识别。结论:成功克隆P2X7R胞外段蛋白编码序列、诱导表达并纯化了重组P2X7R胞外段蛋白,为今后制备抗人P2X7R胞外段蛋白的单克隆抗体奠定了坚实的基础。

重复经颅磁刺激对慢性抑郁小鼠前额叶皮质和海马区P2X7R及GFAP表达的影响

目的观察重复经颅磁刺激(rTMS)对抑郁小鼠前额叶皮质和海马区嘌呤2X7受体(P2X7R)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法将30只C57BL/6小鼠分为对照组(10只)和造模组(20只)。对照组小鼠群居饲养(5只/笼),造模组小鼠在出生21 d后通过断奶独居(1只/笼)饲养6周制作慢性抑郁小鼠模型。采用随机数字表法将16只制模成功小鼠分为模型组及rTMS组,每组8只小鼠。rTMS组小鼠给予10 Hz rTMS干预,每周干预5 d。于rTMS干预4周后观察各组小鼠抑郁样行为改变,并对比各组小鼠前额叶皮质和海马区P2X7R、GFAP表达变化。结果与对照组比较,模型组小鼠蔗糖偏好实验(SPT)中糖水偏好量、旷场实验(OFT)中运动距离均显著减少(P<0.05),悬尾实验(TST)中静止不动时间显著增加(P<0.05),前额叶皮质和海马区P2X7R表达水平均明显增加(P<0.05),GFAP表达水平则显著下降(P<0.05)。与模型组比较,rTMS组SPT糖水偏好量[(75.11±4.58)%vs(65.14±4.87)%]、OFT运动距离[(2289.34±100.16)cm vs(2028.90±178.21)cm]均显著增加(P<0.05),TST静止不动时间[(78.11±10.89)s vs(101.39±10.38)s]明显缩短(P<0.05),前额叶皮质和海马区P2X7R表达均明显降低(P<0.05),GFAP表达则显著增强(P<0.05)。结论rTMS干预能有效改善早期独居小鼠抑郁状态,其治疗机制可能与抑制前额叶皮质和海马区P2X7R表达、促进GFAP表达有关。