1p32缺失在初诊多发性骨髓瘤患者中的预后意义

目的:分析1p32缺失在初诊多发性骨髓瘤(MM)患者中的预后意义。方法:回顾性分析2017年4月至2022年12月在江苏省人民医院就诊的341例初诊MM患者的临床资料,结合遗传学特征,尤其是1号染色体遗传学异常中的1p32缺失,分析患者的生存及预后。结果:341例初诊MM患者中,1p32缺失阳性患者占7.0%(24/341),伴有1p32缺失的MM患者的无进展生存(PFS)显著短于不伴有1p32缺失患者(P<0.001),总生存(OS)同样更短(P<0.001)。COX风险回归分析显示,1p32缺失是影响MM患者生存的独立危险因素。同时伴有1q21扩增和1p32缺失,即“1号染色体双打击”MM患者的PFS及OS相较于仅有1q21扩增或仅有1p32缺失MM患者更差(PFS:P<0.001;OS:P<0.001)。结论:1p32缺失是影响MM患者PFS及OS的独立危险因素,1p32缺失应广泛应用于初诊MM的预后判断。

基于P32蛋白的山羊痘病毒抗体荧光微球检测方法的建立

为建立一种山羊痘病毒(GTPV)抗体快速检测方法,试验将携带GTPV结构蛋白P32基因的重组质粒pET28a-P32转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后获得了重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明该蛋白具有良好的特异性和反应原性。以荧光微球为标记材料对P32蛋白进行标记,通过优化反应条件制备了快速检测GTPV抗体的荧光微球免疫层析试纸条,并对其性能进行评价。结果:该试纸条与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)的阳性血清均无交叉反应;阳性血清稀释至800倍仍能检出阳性,敏感性较高;批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,稳定性较好;与ELISA检测方法对比的总符合率为92.5%。综上,本试验建立的荧光微球试纸条可用于GTPV抗体的快速检测和流行病学调查。

牛结节性皮肤病病毒P32蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为原核表达牛结节性皮肤病病毒(LSDV)P32蛋白并制备其多克隆抗体,本研究基于GenBank中LSDV-P32基因序列,使用多种生物信息学工具对P32蛋白的理化性质及生物学特性进行分析,选择富含B细胞表位的区段连接至pCold-TF载体,优化表达条件,重组蛋白纯化后利用SDS-PAGE和Western blot鉴定。将纯化后的P32蛋白免疫獭兔,制备多克隆抗体,利用ELISA、IFA和Western blot对多克隆抗体进行特性鉴定。结果显示:本研究利用原核表达系统成功表达了可溶性LSDV-P32蛋白,最佳表达条件为诱导温度15℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L、摇床转速120 r/min、诱导时间30 h;制备的兔源多克隆抗体ELISA效价可达1∶409600,可应用于ELISA、Western blot和IFA试验。本研究为LSDV-P32蛋白功能的研究及相关检测试剂研发提供了一定技术支撑。

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。

羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3·1(+)和已插入CpG序列的pcDNA3·1-CpG中,构建pcDNA3·1-P32、pcDNA3·1-CpG-P32和pcDNA3·1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞亚群。结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4+T细胞数目和CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组。结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答。

羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达

根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32。再将P32基因亚克隆入原核表达栽体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58ku左右,与预期大小相符。

山羊痘病毒P32基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,用特异性引物扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,连接于pMD18-T载体,转化到JM109感受态细胞,对重组质粒双酶切、PCR鉴定与序列分析得出:P32结构蛋白基因全长969 bp,编码323个氨基酸.与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因序列同源性分别达99%和97%;与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因编码的氨基酸同源性分别达98.9%和96%.

羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因 ,将其克隆至pMD18_T载体 ,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac_to_Bac○R杆状病毒表达系统中转移载体pFastBac1和pFastBacHTa ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,获得两种携带P32基因的重组转染质粒 :Bacmid_Bac1_P32 ,Bacmid_BacHT_P32 ,经PCR试验鉴定 ,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体 。

羊痘病毒P32蛋白的研究进展

P32蛋白是所有羊痘病毒具有的结构蛋白之一,含有重要的免疫原性决定簇。P32蛋白既是致病的关键因素,也是激发机体产生抗体并产生保护性免疫的主要成分。作者就羊痘病毒P32蛋白的基因组结构、抗原表位及P32蛋白应用于羊痘病毒诊断和免疫方面的研究进展作一综述。

山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPVp32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti)。表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性。以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%。上述结果表明,该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体。本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测。

山羊痘病毒P32基因序列分析及其B细胞表位预测

目的：比较山羊痘病毒不同分离株间P32基因的同源性,并对其B细胞表位进行预测。方法：选取GenBank上10株不同山羊痘毒株P32基因序列,采用DNAsis MAX序列分析软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测P32蛋白B细胞表位。结果：10株不同山羊痘毒株P32基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.4%和98.4%;在P32蛋白的肽链中,19-60、64-80、98-118、138-182和214-275区段亲水性强,17-45、64-75、88-97、110-128、152-165和201-251区段柔韧性好,150-172、200-255区段抗原指数高,而31-59、101-119、142-145、165-172和215-252区段表面可及性高,42-56、159-181、200-208和227-259区段。结论：不同山羊痘病毒株间P32基因具有较高的同源性,P32蛋白227-251区段可能是B细胞表位优势区,为P32蛋白功能的深入研究与新型疫苗的设计提供一定的基础。

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFast-BacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测。结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别。

羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建

提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上,经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析。随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确。

羊痘病毒P32基因生物信息学分析

为获得羊痘病毒P32基因生物信息学资料,扩增山羊痘病毒贵州LD株的P32基因,并进行克隆、测序与序列分析;以P32基因的推导氨基酸序列为材料,应用计算机技术和生物学软件预测P32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构,综合评价P32蛋白的抗原表位。结果表明,羊痘病毒P32基因核苷酸和氨基酸同源性分别达到97.8%和95.6%以上;P32蛋白为含有一个跨膜结构的膜蛋白;肽段227-251区域的各种预测指数均高,推断该区域为一个潜在的优势抗原表位。数据分析显示,P32蛋白具有较强的抗原性,该结果将为GPV P32基因工程疫苗的研究和体外表达产物的应用提供依据。

以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体。方法:以pMD-18T-P32/LD为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出山羊痘病毒P32基因片段,定向插入真核表达载体pVAX1中,再重组表达质粒pVAX1-P32/LD。转入DH5α,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌,通过双酶切、PCR及插入片段序列测序对质粒进行鉴定。结果:携带山羊痘病毒P32基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗S7207/pVAX1-P32/LD已成功构建。结论:为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。

山羊痘病毒p32基因的克隆、表达及单克隆抗体制备

本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。

山羊痘病毒P32基因重组真核表达载体的构建与鉴定

根据已发表的山羊痘病毒P32基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR方法从分离的贵州山羊痘病毒LD毒株中扩增出含P32基因的DNA片段,纯化后,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-P32/LD重组载体。通过PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-P32/LD构建成功。

牛东方泰勒虫P32主要表面蛋白基因的克隆与分析

通过PCR技术从感染吉林株东方泰勒虫的病牛血液中扩增出868bp的表面蛋白P32基因,经测序比较分析发现与韩国株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和98%。和我国延边株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和98%。将所得的吉林株东方泰勒虫P32蛋白基因序列提交GenBank,基因注册号为EU047751。

山羊痘病毒结构蛋白P32基因的表达

将山羊痘病毒结构蛋白P32基因从重组质粒pMD-P32中亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,用构建的重组表达质粒pGEX-P32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导表达,细菌裂解物经SDS-PAGE检测到分子量约为58 ku的目的蛋白,与预期的产物大小一致.Western-blotting表明该重组蛋白可被山羊痘阳性血清所识别.