附睾精子蛋白P34H与男性生殖

哺乳动物精子在附睾转运过程中会获得精 卵相互作用所必需的精子表面蛋白。P34H是由人附睾上皮细胞分泌并定位于精子顶体的精子膜蛋白 ,属于短链脱氢酶 还原酶 (SDR)超家族成员。初步研究表明 ,P34H能够介导精子 卵透明带的结合 ,可作为附睾精子成熟的标志物 ,且低水平的附睾精子蛋白P34H与原发性男性不育显著相关。因此 ,精子表面P34H的水平可以作为男性不育症的一个辅助诊断指标。本文对附睾精子蛋白P34H的分子生物学特性、基因的表达与调控。

人精子表面蛋白P34H重组表达载体的构建及诱导表达

目的 :获得纯化的人精子表面蛋白P34H用于基础和临床研究。 方法 :在克隆到P34H基因编码区全长的基础上 ,将P34H基因亚克隆至原核表达载体pQE 30中 ,构建重组表达载体pQE 30 /P34H。将pQE 30 /P34H转化至大肠埃希菌后 ,用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,通过Ni NTA树脂进行亲和层析纯化上清中可溶性形式的重组蛋白P34H。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序 ,并对重组蛋白P34H行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,鉴定其是否为所需目的蛋白。 结果 :经PCR和双酶切鉴定 ,重组表达载体pQE 30 /P34H为正确克隆。SDS PAGE和DNA测序证实 ,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白。 结论 :用上述原核表达的方法可获得纯化的人精子表面蛋白P34H。

人精子表面蛋白P34H的基因克隆及其在睾丸和附睾中表达分析

目的 :克隆精子表面蛋白P34H基因的编码区 ,为进一步体外表达P34H蛋白做准备。 方法 :提取人附睾体部总RNA ,并以此为模板 ,进行反转录PCR获得编码P34H蛋白的基因片段。应用T/A克隆策略 ,将扩增的P34H基因编码区克隆入T载体 ,并通过双酶切和DNA测序进行鉴定。同时 ,以 β actin为内参照物 ,进行反转录PCR半定量分析 ,比较P34H在附睾头部、体部和尾部及睾丸组织中的表达量。 结果 :成功地克隆了P34H基因。将P34H的cDNA序列登录GenBank ,登录号为AF5 15 6 2 5。反转录PCR半定量分析表明P34H主要在附睾体部表达。 结论

梗阻性无精子症患者附睾蛋白P34h的表达及其意义

目的:探讨梗阻性无精子症患者的附睾组织中附睾蛋白P34h mRNA及蛋白表达情况,并探讨其在梗阻性无精子症患者中的意义。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例因不同梗阻(输精管或射精管水平梗阻)所致的梗阻性无精子症患者附睾组织中P34h基因mRNA的表达水平,Western Blot检测2组P34h蛋白的表达。结果:2组均有P34h mRNA的表达,输精管梗阻的P34h/β-actin均值为0.418±0.045,射精管梗阻的P34h/β-actin均值为0.719±0.069,输精管梗阻的附睾组织中P34h mRNA水平显著低于射精管梗阻(P<0.05)。2组亦均有P34h蛋白的表达,输精管梗阻平均光密度为0.095±0.014,射精管梗阻为0.276±0.054(P<0.05),两组P34h蛋白的表达差异有统计学意义。结论:P34h mRNA及其蛋白在不同梗阻因素所致的无精子症患者的附睾中表达水平有明显差异,提示P34h可能是梗阻性无精子症时导致精子成熟障碍的一个重要因素。

人精子膜蛋白P34H表达与透明质酸酶活性的关系

目的探讨人精子膜蛋白P34H表达和顶体内透明质酸酶活性的关系。方法收集88例精液标本,其中正常生育组20例,不育男性68例。参照世界卫生组织(WHO)标准对标本进行精液常规分析,根据精液参数的不同,将68例不育标本分为正常精液参数不育组和精液参数异常不育组。Western blotting检测P34H蛋白在人精子中的表达,免疫荧光观察P34H蛋白在精子表面的阳性表达率,采用改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测精子顶体内透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)。结果正常精液参数不育组和精液参数异常不育组的精子P34H/β-actin平均吸光度、精子P34H标记阳性率均明显低于正常生育组,经统计学分析差异均有显著性(P<0.05);正常精液参数不育组和精液参数异常不育组的HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与正常生育组比较均有显著下降(P<0.05)。相关性分析提示,精子P34H蛋白表达量与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)存在正相关性,相关系数r=0.449、0.431,P<0.01;精子P34H阳性率与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)存在正相关性,相关系数r=0.727、0.691,P<0.01。结论男性不育患者精子P34H蛋白表达减少,精子P34H阳性率降低以及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)减弱。

抗人精子表面蛋白P34H单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备并鉴定抗人精子表面蛋白P34H的单克隆抗体（McAb）。方法：以重组P34H蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术建立分泌抗P34HMcAb的细胞株，并制备腹水型McAb，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、Western印迹鉴定其敏感性及特异性。结果：获得1株（2CA）IgGlKappa型抗P34HMcAb。ELISA结果表明腹水型McAb效价可达1：10^3～1：10^5，Western印迹显示该McAb既能特异性地结合精子膜蛋白中相对分子质量（Mr）约为34000的天然抗原，又能特异性地结合Mr约为27000重组P34H蛋白。结论：用上述方法成功制备抗P34HMcAb，为进一步研究P34H与男性生殖的关系奠定了基础。

沉默附睾P34H基因对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶活性的影响

目的:通过慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)敲低P34H表达,分析其对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶(HYD)活性的影响。方法:构建3种附睾精子P34H shRNA慢病毒表达载体GV-P34H-sh RNA-1、GVP34H-sh RNA-2和GV-P34H-sh RNA-3,提取阳性克隆质粒测序,转染HEK293T细胞,生产慢病毒颗粒。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别注入小鼠附睾中,用real-time PCR和Western blot法分别检测其对P34H m RNA和蛋白的沉默效果。采用免疫荧光法观察P34H蛋白在小鼠精子上的定位,改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测小鼠精子HYD活性(HYD阳性反应率和HYD活性强度)。结果:测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功。感染小鼠附睾后,P34H的mRNA及蛋白表达量均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P<0.05);其中以GV-P34H-sh RNA-1作用最为显著,精子P34H阳性表达率和HYD活性均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P<0.05),而阴性感染组和正常对照组相比差异无统计学显著性。结论:附睾P34H基因沉默可抑制小鼠附睾中精子P34H阳性表达率和HYD活性。

不育男性精子膜蛋白P34H的表达与中性α-糖苷酶活性的关系

目的:探讨男性不育患者精子膜蛋白P34H的表达与精浆中性α-糖苷酶(NAG)活性的关系。方法:收集精液标本,分为正常生育组和不育组。参照WHO标准方法对标本进行精液常规分析,免疫印迹检测P34H蛋白在人精子中的表达,免疫荧光观察P34H蛋白在人精子上的定位,采用底物酶法检测精浆NAG活性。结果:免疫印迹结果显示,正常生育组的精子P34H蛋白表达和精子P34H阳性率均显著高于不育各组;精子P34H蛋白表达及阳性率在NAG活性正常组与NAG活性异常组差异无统计学意义。相关性分析提示精子P34H蛋白表达及P34H阳性率与精浆NAG活性呈正相关性。结论:精子P34H蛋白表达减少、精子P34H阳性率降低以及NAG活性减弱均会导致男性生育力低下,附睾精子蛋白P34H量和NAG活性可用于评价男性生育能力。

二仙汤及其拆方对肾阳虚证小鼠附睾P34H、Prdx6的影响

目的探讨补肾中药复方二仙汤及其拆方对肾阳虚证小鼠附睾精子成熟微环境的影响。方法 60只成熟雄性ICR小鼠随机挑选10只作为正常对照组,其余50只小鼠腹腔注射地塞米松磷酸钠25mg/(kg·d),连续2周,造模肾阳虚证。造模成功后,随机分成5组:模型组、二仙汤全方组、温肾益精组、滋阴降火组、调理冲任组,每组10只,模型组、正常组予蒸馏水,其余各组予相应中药汤药灌胃,按体质量给予相应剂量,每天2次,连续21d。停药24h后处死动物,免疫组化法检测各组附睾抗人精子表面蛋白34H(P34H)表达,Western Blot法检测过氧化物酶6(Prdx6)的表达。结果肾阳虚证小鼠附睾P34H、Prdx6表达量明显低于正常对照组,组间差异有统计学意义(P<0.05),二仙汤全方组、温肾益精组表达量明显高于模型组,组间差异有统计学意义(P<0.05),调理冲任组、滋阴降火组与模型组表达组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论二仙汤及其拆方可影响肾阳虚证小鼠附睾P34H、Prdx6表达,进而影响精子成熟,其中以二仙汤全方及温肾益精组作用最为明显。

人精于表面蛋白P34H的基因克隆及其在睾丸和附睾中表达的半定量分析

目的 克隆精子表面蛋白P34H基因的编码区，为进一步体外表达P34H蛋白做难备。方法 提取人附睾体部总RNA，并以此为模板，进行反转录PCR获得编码P34H蛋白的基因片段。应用T／A克隆策略，将扩增的P34H基因编码区克隆入T载体，并通过双酶切和DNA测序进行鉴定。同时，以β-actin为内参，进行反转录PCR半定量分析，比较P34H在附睾头部、体部和尾部及睾丸组织中的表达量大小。结果 成功地克隆了P34H基因。将P34H的cDNA序列登录GenBank，登录号为AF515625。反转录PCR半定量分析表明P34H主要在附睾体部表达。结论 克隆的P34H基因可用于构建表达载体，为进一步表达P34H重组蛋白进行有关P34H的基础和应用研究打下了基础。

副睾来源的精子蛋白P34H水平预测常规体外受精结局

A prospective double-blind study was performed to determine if Western blot detection of P34H, a sperm protein of epididymal origin that is involved in the binding to the zona pellucida, is predictive of standard IVF outcome. Our results demonstrate that the proportion of positive P34H cases that produced embryos in vitro clearly differs from caseswith undetectable levels of P34H (P < .001).

精子表面蛋白P34H与男性精子质量关系的研究进展

精子表面蛋白P34H作为附睾上皮分泌的一种物质,并作为精子在附睾内成熟的标志,与男性不育的发生密切相关,而男性不育多由于精子数量减少或精子质量降低。研究显示,精子表面蛋白P34H能介导精卵透明带的结合,并且与精子顶体反应率、精子顶体酶活性、精浆中性a-葡萄糖苷酶、精子透明质酸酶活性呈正相关,其表达水平低下可影响精子质量,阻碍精子成熟,从而引起男性不育症的发生。本文对精子P34H蛋白与男性精子质量的相关性做一综述。