猪肺炎支原体P36蛋白间接ELISA检测方法的建立

将已构建的含有猪肺炎支原体P36基因的酵母表达质粒pPICZα-A-P36在酵母菌X-33里进行表达,并对表达的蛋白进行Western-blotting鉴定。将其作为包被抗原包被酶标板,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,并分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,最终建立了稳定的抗猪肺炎支原体IgG的间接ELISA检测方法。应用该方法检测猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪圆环病毒阳性血清等都是阴性,说明该方法具有良好的特异性。批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于8%,说明该方法具有良好的重复性。利用该方法检测猪肺炎支原体活疫苗(168株)免疫猪血清中IgG的动态变化,结果表明,免疫猪血清中的IgG在免疫后分泌逐渐增加,直至免疫后8周,而经强毒攻毒后抗体滴度明显增高。

猪肺炎支原体P36基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中猪肺炎支原体P36基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白基因P36,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P36。PICZα-A-P36经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P36蛋白于发酵上清液中,通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了分泌性表达,而且具有良好的反应原性,这为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

屠宰猪猪肺炎支原体P36、P46、P97 R1、P146氨基酸序列的差异分析

为了解猪肺炎支原体流行菌株遗传变异情况,选取2014-2017年不同时间、地点收集的17头猪肺炎支原体阳性屠宰猪肺脏灌洗液DNA为模板,进行猪肺炎支原体P36(编码具有强免疫原性的胞浆蛋白)、P46(编码具有强免疫原性的表面蛋白)、P97 R1区、P146高变区(猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的重要功能区域)基因的PCR扩增、测序。结合GenBank登录的猪肺炎支原体相关序列进行氨基酸序列的比对分析。结果表明,比对的序列之间,P36、P46蛋白氨基酸序列同源性均在98.9%以上,但P97功能区R1区、P146多变区在菌株间存在较大差异。11个屠宰猪样本和5个GenBank登录菌株P97 R1区重复氨基酸序列数量达到14个以上,而GenBank登录的3个疫苗相关菌株(168株、168-L株、J株)及另外4个菌株、4个屠宰猪样本重复序列为9～11个不等;P146高变区氨基酸序列的差异主要集中在2个重复氨基酸序列区(R1、R2),GenBank登录的168株、168-L株、J株以及另外2个菌株,1个屠宰猪样本在R1区出现较多氨基酸缺失。168株、168-L株,6个屠宰猪样本及另外3个GenBank登录菌株在R2区出现了3～9个不等的氨基酸缺失。利用DNAStar进行抗原表位预测发现,菌株间P97 R1、P146 R1、P146 R2区氨基酸序列的差异,导致了抗原表位出现明显的变化。提示开展P97、P146等黏附因子的筛选和研究或许能进一步提升疫苗阻止猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的作用,从而进一步改善疫苗的免疫效果。

猪肺炎支原体特异性蛋白P36基因的克隆与表达

根据Genbank中猪肺炎支原体P36基因序列设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出猪肺炎支原体ZCF23株特异性蛋白P36基因序列,经测序确认后,克隆入原核表达载体pGEX6p＿1的EcoRI和XhoI位点之间,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDS＿PAGE电泳进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了表达,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件。

抗猪肺炎支原体特异性P36蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

表达P36基因的重组菌BL21(6P-1-P36)经诱导表达,超声波裂解后高速离心,分别收集上清和沉淀。可溶性表达产物亲和层析纯化后用于单抗筛选;同时,用GST-P36包涵体抗原腹腔注射免疫BALB/c小鼠(400μg/只)。利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得了1株能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株5A7-2。生物学特性鉴定表明,腹水单抗的间接ELISA效价为1∶2.5×106;免疫球蛋白亚类为IgG2a。免疫印迹结果显示,腹水单抗能与GST-P36融合蛋白反应而不与谷胱苷肽转移酶(GST)反应,并且在猪肺炎支原体(Mycop lasma hyopneumoniae,Mhp)蛋白36000位置也有明显的条带,说明5A7-2所分泌的是针对MhpP36蛋白的单抗。P36蛋白是Mhp种特异性蛋白,其单克隆抗体的制备,为Mhp种特异性检测方法的建立奠定了基础。

戊糖片球菌P36对HepG2细胞抗氧化能力影响的初步研究

目的:研究戊糖片球菌P36对Hep G2细胞抗氧化能力的影响。方法:将培养的Hep G2细胞分为3组:空白对照组(不加H2O2)、模型组(加入H2O2)和乳酸菌组(加入戊糖片球菌P36和H2O2)。细胞培养至12 h和24 h时分别测定其上清液和细胞裂解液的抗氧化活性。利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)对Hep G2细胞进行染色,在荧光显微镜下观察不同组细胞核形态的变化。结果:添加戊糖片球菌P36 12 h后,与模型组相比,细胞上清液中的总抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力和过氧化氢酶(catalase,CAT)活力均显著提高(p<0.05)。细胞裂解液中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力也显著提高(p<0.05);与模型组相比,添加P36 24 h后,细胞上清液中的抗氧化酶活力均显著增加(p<0.05),还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量分别显著降低(p<0.05),细胞裂解液中的SOD活力显著降低了19.76%(p<0.05)。加入戊糖片球菌P36 24 h后,与模型组相比,Hep G2细胞受损程度降低,大部分细胞状态趋于正常。结论:戊糖片球菌P36可以提高氧化应激状态下Hep G2细胞的抗氧化能力。

伴有染色体1p36缺失的高危神经母细胞瘤自体造血干细胞移植巩固治疗的近期疗效分析

目的总结和分析伴有染色体1p36缺失的高危神经母细胞瘤(HR-NB)的临床特征,分析这些患儿经过自体造血干细胞移植巩固治疗后的近期疗效,为进一步提高HR-NB生存率提供参考依据。方法回顾性分析2014年4月-2016年4月,北京儿童医院血液肿瘤中心收治的HR-NB患儿的临床资料。HR-NB诊断标准、临床分期、治疗方案和疗效标准均根据北京儿童医院HR-NB方案(BCH-HR-NB-2007),入组患儿为同时伴有染色体1 p36缺失,且均经过系统治疗和随访的HR-NB。随访至2016年12月31日。结果入组患儿共11例(男4例,女7例),平均年龄43个月,临床分期均为INSS-Ⅳ。肿瘤原发于后纵隔3例,腹膜后或肾上腺8例。骨髓转移11例,骨骼转移10例,均为多发骨转移,远处淋巴结转移6例,肝脏等内脏转移5例,中枢转移2例。伴有N-myc基因扩增4例。全部患儿术前化疗4~5个疗程,回输干细胞计数为(2.62~10.68)×10~6/kg,中位随访时间14.9(9~32)个月。4例患儿复发或进展,其中1例停维甲酸3个月后骨髓复发,放弃治疗后死亡;另3例分别于干细胞回输后第3、5和6个月,维持治疗中肿瘤进展,2例放弃后死亡,1例仍在治疗中。余7例患儿处于肿瘤稳定状态。结论伴有染色体1 p36缺失的HR-NB患儿,骨髓和骨骼转移率极高,约1/3同时伴有N-myc基因扩增。自体造血干细胞移植巩固治疗后3~6个月内,仍然容易出现肿瘤进展。提示肿瘤恶性程度高,很容易进展或复发,在干细胞移植巩固治疗后维持治疗期间仍需要增加全身治疗的强度。

特纳综合征合并1p36缺失综合征误诊为甲减1例报告

1例身材矮小、原发性闭经就诊的女性患者进行染色体核型分析为45X核型,用微阵列比较基因组杂交技术扫描基因发现1p36缺如,并在多个染色体上基因有异常,临床主要表现为身材矮小、女性第二性征缺如、原发闭经、直肠扩张、内生殖器缺如,伴有甲状腺功能减退,智力一般等特征。容易被临床某一种表现而误诊,需要高度关注。

肝细胞癌染色体1p36杂合子丢失及其与临床病理特征关系的研究

目的 :探讨肝细胞癌 (HCC)在染色体lp36杂合子丢失 (LOH)的特点及其与临床病理表现的相关性。方法 :采用毛细管电泳DNA分析系统 ,对 5 6例HCC中染色体 1p36上 10个微卫星的杂合子丢失进行检测。结果 :5 6例HCC在 1号染色体上 10个基因座发生LOH的总频率为 6 9 6 % (39/ 5 6 ) ,LOH以RIZ最高为 76 7% ,其次为D1S199(5 3 3% )。LOH与血清AFP、HBsAg、肿瘤大小、Edmondson分级和转移等临床病理学参数无明显关系 ;D1S2 893和D1S5 0 7基因座 ,血清HBsAg阳性患者的LOH频率显著高于HBsAg阴性者 (P <0 .0 1) ,D1S199基因座 ,血清AFP阳性者的LOH明显高于血清AFP阴性者 (P =0 0 0 1) ;D1S4 6 8基因座 ,无肝内转移者的LOH显著高于肝内转移者 (P <0 0 1)。结论 :HCC在染色体lp36上存在广泛的LOH ,其在HCC的发生和发展过程中起重要作用 ,而特定基因座的LOH与临床和病理学参数有一定的相关性。

蛋白激酶底物P36在人膀胱肿瘤中的表达及意义

应用ＳＰ免疫细胞化学方法，检测３０例膀胱肿瘤组织中Ｐ３６的分布及表达．结果显示，１６例表达阳性，总阳性率为５３．３％，它主要分布在胞浆内（占６２．５％）和胞膜上（３７．５％）．在肿瘤分化越差，浸润越深及复发和死亡的病例中，其阳性染色越强．结果提示，Ｐ３６做为细胞信号传导系统中的重要分子，与膀胱肿瘤的发生发展关系密切，是判定膀胱肿瘤恶度及预后的有意义的标记物．

戊糖片球菌P36胞外多糖体外抗氧化能力的研究

本研究主要从清除DPPH自由基的能力,清除超氧阴离子自由基功能、清除羟自由基和清除ABTS自由基的能力测试来评价戊糖片球菌P36胞外多糖的体外抗氧化功能。结果表明,随着胞外多糖浓度的升高,其抗氧化能力也随之增加,其中DPPH自由基的清除率最高可达到30%以上。此结果为戊糖片球菌P36胞外多糖的应用奠定了理论基础。

BPDE诱发16HBE恶性转化过程中eIF3 p36的表达变化

目的探讨二羟环氧苯并芘(BPDE)诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段真核生物蛋白翻译启始因子(eIF3p36mRNA)表达水平的变化,为进一步阐明BPDE的分子致癌机理提供线索。方法应用RT-PCR和FQ-PCR方法,检测并分析BPDE诱发16HBE恶性转化不同阶段的eIF3p36mRNA表达量的变化。结果相对于非转化对照细胞,BPDE诱发恶性转化16HBE不同阶段细胞(转化细胞和成瘤细胞)的eIF3p36mR-NA基因表达水平均显著高于对照组(P<0.01或P<0.05),其中BPDE-转化细胞的eIF3p36平均表达量分别是对照细胞的2.3～5.1倍;而BPDE-转化细胞与BPDE-成瘤细胞的eIF3p36平均表达量相比,差别无显著性(P>0.05),提示eIF3p36的异常表达量与BPDE诱发16HBE细胞恶变程度之间存在一定的正向关系。结论BPDE在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的eIF3p36的异常表达现象,其表达水平与细胞的恶变程度密切相关,这可能是BPDE诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机理之一。

胶质母细胞瘤染色体1p36杂合性缺失的初步研究

目的探讨1p36上可能存在的与胶质母细胞瘤(GBM)发生有关的肿瘤抑制基因的缺失区域,为发现和定位肿瘤抑制基因提供线索和依据。方法运用聚合酶链反应(PCR)技术为基础的杂合性缺失分析(LOH)法对12例胶质母细胞瘤染色体1p36上12个微卫星多态标记序列作了较详细研究。结果12例胶质母细胞瘤至少有一个位点出现杂合性缺失者11例,总缺失率为91.7%(11/12),其中以D1S214-D1S2666位点间区域LOH的频率最高。结论胶质母细胞瘤染色体1p36发生高频率杂合性缺失,提示位点D1S214-D1S2666缺失区域间可能存在着与GBM发生有关的抑癌基因。

p36蛋白在人膀胱肿瘤中的免疫组化研究及其临床意义

应用免疫组化(S-P法)检测了30例膀胱肿瘤组织中p36蛋白的分布和表达。结果显示30例中16例表达阳性,阳性率为53.3%。其阳性染色主要分布在胞浆内的10例(62.5%),胞膜上的6例(37.5%)。在肿瘤细胞分化程度越低,浸润越深及复发和死亡的病例中,其阳性染色越强。它们之间对比差异有显著性(P<0.05)。结果提示,p36蛋白作为细胞信号传导系统中的重要分子,与膀胱肿瘤的发生发展关系密切,是判定膀胱肿瘤恶性程度及预后的有价值的标志物之一。

快堆核电站用P36无缝钢管的研制

介绍了快堆核电站核岛用P36无缝钢管的性能特点、生产工艺方案及其关键技术。对P36无缝钢管的化学成分及组织性能检验结果表明,衡阳华菱钢管有限公司研制的P36无缝钢管的化学成分、力学性能等均满足ASME SA-335/SA-335M规范的要求,能够满足快堆核电站主给水系统对低合金无缝钢管的需求,其生产工艺在核电用管生产领域具有推广应用价值。

1p36.33-32缺失所致婴儿痉挛症1例并文献复习

通过对1例表现为横眉、双眼稍凹陷、智力语言运动明显低下、难治性癫痫、痉挛发作的患儿进行染色体微矩阵检测,发现1p36.33-1p36.32区域缺失,探讨1p36.33-32缺失的临床特征与遗传学特点。应用促肾上腺皮质激素(ACTH)、多种抗癫痫药、生酮饮食治疗,治疗有效但易复发,产前诊断可能有效减少本病的发生。

染色体1p36缺失综合征2例诊断及随访

目的探讨1p36缺失综合征的临床特征。方法应用染色体微阵列分析技术(CMA)对2例有特殊面容的生长发育落后患儿进行基因检测,并长期随访例1患儿身高和体质量。结果患儿男女各1例,均表现为特殊面容、肥胖、矮小、智力低下,尤其是语言发育落后;应用CMA发现2例患儿1p36.33-1p36.32区域均有缺失,例1女性患儿为1757kb的杂合缺失,例2男性患儿为2533kb的杂合缺失,均确诊为1p36缺失综合征。例1女性患儿自7岁起长期随访身高增长,发现其12岁起身高曲线自-2SD向下偏离。结论1p36缺失综合征有典型面容特征,智力障碍,尤其是语言发育落后,矮小。女性患者可能因青春期中期身高增速减缓而导致终身高矮小。CMA有助于明确诊断。

蛋白激酶底物p36在肝硬变、肝细胞肝癌中的表达及与HBV、HCV感染的关系

本文应用鼠抗蛋白激酶底物ｐ３６单克隆抗体，采用免疫组织化学法对ｐ３６在５４例肝硬变，７９例肝细胞肝癌中的表达分布进行了研究，同时结合ＨＢＶ、ＨＣＶ感染情况分析其相互关系，结果显示：ｐ３６在肝硬变及肝细胞肝癌中定位于肝细胞或癌细胞胞浆内，在胞浆内弥漫分布，阳性细胞呈灶状或弥漫分布，部分病例癌周肝细胞信号较癌组织为强，ｐ３６在肝硬变、肝细胞癌中的阳性率分别为８８．８％（４８／５４）及８２．３（６５／７９），ＨＢｘＡｇ在两种组织的阳性率分别为７０．４％及７６％，ＨＣＶ核心抗原在两种组织的阳性率分别为８０％及７８．５％；三者同时阳性分别为５５．５％及５８．２％；ｐ３６、ＨＢｘＡｇ同时阳性分别为６８．５％及６４．５％；ｐ３６、核心抗原同时阳性分别为７４．１％及７０．８％，我们的结果提示，肝硬变、肝细胞肝癌组织中ｐ３６存在高表达，其高表达可能与ＨＢＶ。

5例1p36微缺失流产胎儿的遗传学诊断及文献回顾

目的:对5例稽留流产绒毛进行遗传学检测,明确其病因和发生机制,为夫妇再次生育时复发风险评估及产前诊断提供依据。方法:应用Affymetrix CytoScan 750K染色体微阵列芯片(chromosomal microarray analysis,CMA)对5例稽留流产绒毛进行全基因组拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析,同时根据检出CNV片段大小及家属意愿,对5对夫妇设计合理的家系验证方案,以明确1p36微缺失的来源。结果:CMA检测结果显示胎儿1在1p36.32p36.31存在1.75 Mb微缺失,胎儿父母常规核型分析和CMA检测均未见异常,但仍不排除父母一方是否为该片段插入易位携带者;胎儿2和3的CMA结果分别为1p36.13p36.12区带存在5.10 Mb微缺失和1p36.33p36.22区带存在9.21 Mb片段缺失,两者父母高分辨核型分析均未见异常,定制荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)探针检测也未发现该位点的缺失、重复或易位重排等异常,应为新发异常。CMA提示胎儿4和5分别在1p36.33p36.22和1p36.33p36.23区带存在9.28 Mb和7.64 Mb微缺失,胎儿4父母高分辨核型正常,胎儿5父母拒绝进一步行家系验证。结论:本文在国内外首次报道了5例1p36缺失综合征引起的早孕期复发及偶发性流产,包括2例中间缺失和3例单纯末端缺失。CMA可发现流产胎儿隐匿性染色体亚显微结构变异,结合常规/高分辨核型分析、FISH、CMA等技术的优缺点,制定合理的家系验证方案,有助于明确染色体变异发生机制,对夫妻再孕时产前诊断和再发风险评估有重要价值。

Expression and significance of protein kinase substrate P36 in human urinary bladder cancer

Distribution and expression of P36 in 30 cases of urinary bladder cancer were studied with SP immunocytochemistry. The findings showed that P36 located mainly in the cytoplasm with a small amount in cellular membrane and its total positive rate was 53. 3%. In patients whose tumor cells were deeply infiltrated and poorly differentiated, and who relapsed and died, the positive staining was stronger. The result indicates that P36 is an important molecule closely related to trans formation of bladder cancer. It is an essential marker for judging the malignancy and prognosis of bladder cancer.