重组猪鼻支原体P37蛋白的原核表达及免疫原性分析

P37是猪鼻支原体(Mhr)的主要免疫原之一,也是Mhr中目前唯一已知的与肿瘤直接相关的抗原。为原核表达Mhr P37蛋白并分析其免疫原性,本研究通过人工合成能够在E.coli中优势表达P37蛋白的编码序列,以pET-28a(+)为载体对P37重组蛋白进行原核表达。SDS-PAGE及western blot鉴定结果表明,表达的P37重组蛋白约为45.97 ku并能够被Mhr高免血清识别。利用纯化的重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法,检测结果显示与Mhr高免血清呈强阳性反应。此外,将P37重组蛋白免疫小鼠,能够诱导高滴度特异性抗体,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究结果为Mhr检测方法的建立、P37蛋白功能研究以及P37相关重组肿瘤疫苗和Mhr疫苗的研制奠定基础。

非洲猪瘟病毒p37蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体制备

【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号:MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE对重组蛋白的可溶性进行分析。收集菌体进行超声破碎,分离沉淀并使用8 mol/L尿素变性后离心,用0.45μm滤膜过滤离心后的上清,使用镍亲和层析柱纯化蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting对其纯化效果及特异性进行验证。将纯化后的p37蛋白按照50μg/只免疫小鼠,制备抗ASFV p37蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价;通过Western blotting、间接免疫荧光试验检测该多克隆抗体的特异性。【结果】生物信息学分析表明,p37蛋白为稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(45.28%)、延伸链(15.09%)、无规则卷曲(31.54%)。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,经IPTG诱导后,成功表达重组蛋白p37,大小62 ku左右,主要以包涵体形式存在,且能与His单克隆抗体发生反应。间接ELISA结果显示,制备的鼠源多克隆抗体效价为1∶256000。Western blotting结果显示,在42 ku左右出现了特异性条带;间接免疫荧光显示出了特异性的红色荧光,表明该多克隆抗体能与重组杆状病毒表达的p37蛋白发生反应,具有较好的特异性。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV p37蛋白,制备了抗ASFV p37蛋白多克隆抗体,重组蛋白具有较好的免疫原性,能产生较强的免疫反应,为后续ASFV p37蛋白结构功能研究、抗体及相关疫苗研发奠定基础。

P53Δ37蛋白3′-5′核酸外切酶活性的初步研究

1996年 Mum menbrauer等发现野生型 P5 3蛋白具有内在的依赖 Mg2 + 的 3′- 5′核酸外切酶活性。本研究对一种缺陷型 P5 3蛋白 P5 3Δ 37是否具有这种核酸外切酶活性进行初步研究。结果发现 :P5 3Δ 37蛋白同样具有 3′- 5′核酸外切酶活性 ,并随着蛋白量的增加而增加 ,但一磷酸鸟嘌呤对该外切酶活性没有抑制作用。哺乳动物细胞内有许多过程涉及到核酸外切酶功能 ,如 DNA复制、DNA重组及 DNA修复 ,因此 ,这一功能在 DNA复制。

抗P37多克隆抗体的制备 纯化与鉴定

目的:用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据。方法:诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blot-ting检测抗血清特异性。结果:免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达。结论:成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具。

猪鼻支原体蛋白P37诱导人外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子

胃癌组织中存在较高的猪鼻支原体感染率,提示猪鼻支原体感染同胃癌的发生可能存在某种相关性.由于肿瘤坏死因子(TNF-α)在微生物感染导致肿瘤发生中起重要作用,而P37蛋白是猪鼻支原体的主要免疫原,因此,探讨P37能否诱导TNF-α的表达与释放,对阐明猪鼻支原体在胃癌发生中的可能分子机制有重要意义,运用PCR技术克隆了p37基因,在对其编码序列中7个色氨酸密码子TGA进行TGG定点突变后,利用PGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌中成功表达了P37蛋白,并经Western blot得到证实,在此基础上,利用RT-PCR及TNF-α敏感细胞株L929的细胞毒性实验,发现P37确能诱导外周血单核细胞表达和释放TNF-α,抗P37单克隆抗体PD4对该诱导活性有明显的中和作用,结果提示,猪鼻支原体通过P37诱导TNF-α产生在猪鼻支原体感染所致相关疾病中可能起重要作用,值得进一步研究.