HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P<0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16^INK4a启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967^-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.

两种启动子调控下的CBF4基因植物表达载体的构建

目的:构建由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体。方法:用EcoRⅠ酶将CBF4和CBF4P两个基因切下,连接到BluescriptM13(SK)上,分别构建成两个中间载体SK-CBF4和SK-CBF4P,再利用SK上的多克隆位点与植物表达载体p3301上相同的酶切位点,将CBF4和CBF4P连接到植物表达载体p3301上,分别构建了由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体p3301-CBF4和p3301-CBF4P。结果:用PCR扩增重组质粒p3301-CBF4和p3301-CBF4P,分别得到了670bp和1200bp的特异性片段。酶切检测也分别得到了与预期结果一致的DNA片段。结论:所构建的两个表达载体均正确,可用于植物遗传改良和两种启动子的启动效率的研究。

三氟拉嗪通过诱导p16^INK4a抑制BGC-823细胞增殖

为探索三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)抗肿瘤作用机制,对胃癌BGC-823细胞进行TFP(5、10μmol/L)处理后,利用计数法、BrdU脉冲标记法、Western印迹等方法从细胞形态、细胞增殖、S期细胞百分比以及相关因子表达水平等方面进行分析.结果显示,TFP处理后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖受到明显抑制且呈时间计量效应关系;S期细胞比例下降;p16INK4a表达水平升高.为进一步研究TFP诱导p16INK4a表达的分子机制,本实验采用插入p16INK4a启动子片段及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16INK4a(-967～-165 bp),研究了TFP在转录水平对p16INK4a启动子活性的影响.结果表明,TFP能够提高p16INK4a的启动子活性.上述结果提示,TFP通过诱导p16INK4a表达抑制BGC-823细胞增殖.