极低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞增殖及P42活化蛋白激酶活性的影响

目的:研究极低密度脂蛋白(VLDL)对SD大鼠系膜细胞(MCs)的促增生作用以及VLDL对MCs P42有丝分裂原活化的蛋白激酶(P42 MAPK)活性的影响.探讨P42 MAPK介导的细胞内信号转导途径在上述系膜细胞增生中的作用.方法:采用XTT法测定不同时间、不同浓度VLDL对MCs的促增生作用,借助流式细胞术观察细胞凋亡情况以了解VLDL对MCs是否具有毒性作用;通过同位素标记法测定MCs P42 MAPK活性;观察P42 MAPK抑制剂PD98059抑制该激酶后MCs的增生情况以及激酶活性变化.结果:①不同浓度VLDL(10～500μg/m1)、不同时间(6～48h)与XTT光密度(AD)值呈线性关系[r分别为0.911(P＜.01、0.651 P＜0.05)].当VLDL浓度达1000μg/ml时,MCs出现凋亡;②VLDL可以以剂量关系(10～1000μg/ml)促进MCs的P42 MAPK活性(r=.872,P＜0.05);随VLDL刺激时间延长,P42 MAPK活性增加,但不呈线性关系,分别在30 min、6h、48 h出现波峰[分别为(118.67±6.43)cpm/k、(140.50±17.68)cpm/k与(128±5.66)cpm/k];③PD98059抑制了P42 MAPK后,P42 MAPK活性显著降低;不同浓度、不同时间VLDL刺激MCs后的XTTAD值也显著降低.结论:①在一定浓度内(10～500μg/ml)VLDL可以以浓度、剂量依赖性的关系促进MCs的增生,但高浓度则可促进细胞凋亡,具有毒性作用;②VLDL可以活化P42MAPK;③VLDL可以通过P42 MAPK途径介导促进MCs增生,而且可能是仅通过该激酶途径介导促进MCs增生.

姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察姜黄素对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法分别用20 ng/ml TNF-α、20μmol/L姜黄素、20 ng/ml TNF-α联合20μmol/L姜黄素作用于体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,MTS/PMS法检测VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法分别测定VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。结果(1)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs增殖无显著作用(P>0.05)。与TNF-α组比较,姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的大鼠VSMCs的增殖(P<0.01);(2)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),TNF-α的这一作用能被姜黄素所抑制(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达无显著作用(P>0.05)。结论一定剂量的姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。

阿司匹林对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察阿司匹林(ASA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,分别用20 ng/mL TNF-α、1 mmol/L ASA、2 mmol/L ASA、20 ng/mL TNF-α+1 mmol/L ASA、20 ng/mL TNF-α+2 mmol/L ASA作用24 h,并设立相关对照组进行比较。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK表达。结果 (1)与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用ASA对大鼠VSMCs的增殖无明显作用(P>0.05)。TNF-α联合ASA组与TNF-α组比较,联用能明显抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖(P<0.01)。(2)与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),单独应用ASA对二者的表达无明显作用(P>0.05)。TNF-α联合ASA组与TNF-α组比较,联用可显著降低这两种蛋白的表达水平(P<0.05)。结论一定剂量的ASA可明显抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK蛋白的表达。

针对STAT3的siRNA抑制HepG2细胞增殖和p44/42MAPK蛋白的表达

目的研究STAT3信号传导通路对HepG2细胞p44/42MAPK蛋白表达和细胞生长的影响。方法将针对STAT3的siRNA转染入HepG2细胞以沉默STAT3基因的表达,采用MTT法检测细胞生长,采用Western blot法检测STAT3和p44/42MAPK蛋白的表达。结果对照组和lipofectamineTM2000处理组细胞生长无明显差异(q=0.97,P>0.05),而siRNA处理组细胞生长被明显抑制(q=9.36,P<0.05);SiRNA转染后24h、48h、72h和96h,细胞抑制率分别为33.2%、39.6%4、3.1%和33.9%s,iRNA在96h后抑制作用减弱,细胞开始重新繁殖;转染细胞72h和96h后,可见STAT3蛋白表达均被抑制(t=14.12,P<0.05),p44/42MAPK蛋白表达未被抑制(F=3.99,P>0.05),而p-p44/42MAPK蛋白表达增加(t=16.30,P<0.05)。结论 STAT3信号传导通路可以影响细胞生长及p44/42MAPK蛋白质的磷酸化,而p-p44/42MAPK的表达增加可能代偿了沉默STAT3引起的细胞生长抑制,使细胞重新繁殖。

p42/44MAPK对PGF_(2α)所致大鼠子宫平滑肌收缩中Connexin43表达的介导

为探讨 p4 2 / 4 4促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) -间隙连接蛋白 4 3(Cx4 3)信号途径与 PGF2α致大鼠子宫平滑肌收缩的关系 ,采用 RT- PCR技术检测 Cx4 3m RNA表达水平 ,采用 western- blot方法检测 Cx4 3蛋白表达水平。结果表明 :PGF2α增强子宫平滑肌收缩时 ,伴有 Cx4 3m RNA和蛋白表达水平增高 ;PD980 5 9(MEK1抑制剂 )部分抑制PGF2α致大鼠子宫平滑肌的收缩 ,同时还可抑制 PGF2α所致的 Cx4 3m RNA和蛋白表达水平的增高。提示 :p4 2 / 4 4 MAPK-Cx4 3信号途径参与

P-P42/p44在慢性肾功能不全大鼠肾组织表达特征及其作用

目的探讨慢性肾功能不全大鼠肾组织磷酸化P42/p44丝裂原活化蛋白激酶(P-P42/p44 MAPK)的表达特征及其可能的作用。方法16只Wistar大鼠随机分成实验组和对照组,每组8只。采用5/6肾切除方法构建慢性肾功能不全大鼠模型,术后120d处死大鼠,取大鼠肾组织行石蜡切片,PAS染色观察大鼠肾脏病理改变,免疫组化和Western blot法分别检测大鼠肾组织磷酸化P42/p44丝裂原活化蛋白激酶的表达特征及活性变化。结果术后120d实验组大鼠与对照组相比,出现明显的肾小球硬化和肾小管坏死等慢性肾功能不全的典型病理特征,免疫组织化学染色检测磷酸化p42/p44 MAPK黄棕色染色颗粒明显增加。Western-blot结果显示,实验组大鼠肾组织磷酸化P42/p44丝裂原活化蛋白激酶(P-P42/p44 MAPK)活性表达水平明显上调(P<0.01)。结论磷酸化P42/p44丝裂原活化蛋白激酶在慢性肾功能不全大鼠模型的肾组织中活性明显升高,可能是慢性肾功能不全时各种细胞外刺激因素介导肾脏纤维化的重要途径之一。

中脑星形胶质细胞源性神经营养因子在视网膜Müller细胞中诱导激活p44/42丝裂原活化蛋白激酶信号通路的实验研究

目的中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)可能对视网膜光感受器细胞和视网膜神经节细胞具有保护性作用。但是其作用机制还不清楚。本研究探索MANF在视网膜上的作用通路,为其在眼科的应用奠定基础。方法选用Sprague-Dawley雄性大鼠25只,体重0.2~0.25 kg。采用数字表法,随机将大鼠分为未处理组和处理组。其中,未处理组5只,处理组左眼注射重组人MANF10μg (3μl),右眼注射磷酸盐缓冲液(PBS)3μl,分别于注射后0.5 h、1 h、2 h及4 h四个时间点取材视网膜,每个时间点5只大鼠。新生大鼠视网膜分离培养原代Müller细胞,100ng/ml MANF处理细胞后,在不同时间点收集细胞Western blot检测磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达水平,冰冻切片免疫组化检测MANF诱导活化的磷酸化p44/42MAPK在视网膜上的定位。以Image J图像分析软件分析图像,Western blot条带密度比值和免疫荧光强度为计量资料以(x±s)表示;各时间点与未处理组组间,采用独立样本t检验的方法进行比较。结果 SD大鼠玻璃体腔注射MANF后,磷酸化p44/42MAPK的表达在0.5 h就开始明显升高,1 h达到高峰,较对照玻璃体腔注射PBS组和未处理组差异均具有统计学意义(t=21.18,4.41;P<0.05),然后逐渐下降,4 h降至未处理组水平。冰冻切片免疫组化检查结果显示磷酸化p44/42MAPK阳性的细胞位于视网膜内核层的Müller细胞,其荧光强度显著高于阴性未处理组,差异有统计学意义(t=11.41,P<0.05)。原代培养的Müller细胞经MANF处理后,磷酸化p44/42MAPK在5 min时较未处理组就有显著升高,差异有统计学意义(t=4.48,6.43;P<0.05),15 min达到高峰,差异有统计学意义(t=19.57,9.18;P<0.05),到30 min降至正常水平。结论 p44/42MAPK信号通路参与了MANF的神经保护作用机制。MANF直接作用于视网膜Müller细胞,可能通过与Müller细胞的相互作用起到细胞保护性作用。

hper1干扰质粒的构建及hper1功能的初步研究

目的构建高效的针对hper1(人类period1基因)的干扰质粒,并对hper1的功能进行初步研究。方法选择4个hper1的干扰位点,根据位点序列合成构建4个pTER-hper1干扰质粒,并通过测序验证。将4种干扰质粒分别转染至SH-SY5Y细胞,经马血清休克诱导后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测hper1mRNA的表达,鉴定干扰效果。提取细胞总蛋白,Western Blot检测P-p44/42丝裂原活化蛋白激酶(mitagen-actinated pratein kinase,MAPK)表达。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-Ⅱ干扰质粒干扰效率最高,hper1表达量降低84.9%。Western Blot显示hper1表达受抑制后,P-p44/42MAPK水平升高。结论成功构建并筛选到具有显著干扰效率的pTER-hper1干扰质粒,为进一步研究hper1的功能奠定了基础,并发现hper1对MAPK通路具有负相调控作用。

氯化镉致豚鼠肾上腺皮质细胞凋亡作用

目的探讨P44/42丝裂素活化蛋白激酶(P44/42MAPK)在CdCl2诱发豚鼠肾上腺皮质细胞凋亡中的作用机制。方法原代培养豚鼠肾上腺皮质细胞,以0,12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl2处理细胞2 h,及100μmol/L的CdCl2处理0,0.5,1,2,3和4 h,以Annexin V碘化丙啶(PI)联合染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;0,12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl2处理1 h,或者100μmol/L的CdCl2处理0,15,30,60,90和120 min;采用蛋白印迹(Western Blot)法分析P44/42总蛋白量、磷酸化水平以及c-Fos的表达水平。结果CdCl2以时间和剂量依赖的方式诱导细胞凋亡,0,12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl2处理细胞2 h后,凋亡率分别为1.99%,14.79%,35.28%,44.62%,55.91%及73.48 7%;100μmol/L CdCl2染毒0,0.5,1,2,3和4 h,细胞凋亡率分别为1.04%,14.70%,33.99%,49.36%,61.57%及71.55%。CdCl2诱发P44、P42磷酸化水平升高及c-fos的高表达,以25,50,100和200μmol/L CdCl2染毒1 h,P44磷酸化水平分别升高了1.0,1.2,2.1和3.2倍;100和200μmol/L CdCl2染毒1 h,P42磷酸化水平升高了0.8和1.3倍;12.5,25,50,100和200μmol/L CdCl2处理细胞1 h,c-Fos的表达水平升高了0.6,1.2,1.4,2.3和1.8倍。100μmol/L CdCl2作用细胞15,30,60,90和120 min后,P44磷酸化水平分别升高了0.5,3.1,4.9,5.9和5.3倍;P42的磷酸化水平分别升高了0.1,0.5,0.9,1.1和1.1倍,同时c-Fos蛋白水平分别升高了1.6,2.3,2.3,3.1和2.8倍。结论一定剂量CdCl2作用肾上腺皮质细胞后,P44/42呈现过度磷酸化,并可能通过诱发c-Fos高表达,导致细胞凋亡。

胰岛素样生长因子Ⅱ激活宫颈癌细胞株ERK1/2信号通路并诱导其增殖

目的探讨胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)激活宫颈癌SiHa细胞株ERK1/2(p42/44MAPK)信号通路的模式变化及对其增殖的影响。方法用MTT法观察细胞增殖,用Westernblot测定细胞p42/44MAPK磷酸化表达。结果IGF-Ⅱ可诱导SiHa细胞增殖,并呈剂量依赖性;用IGF-IR单克隆抗体(1,5,10μmol/L)预处理30min可显著抑制IGF-Ⅱ(20ng/mL)诱导的SiHa细胞增殖,并呈剂量依赖性。IGF-II(100ng/mL)可诱导SiHa细胞p42/44MAPK磷酸化表达,20min达到高峰;IGF-IR单克隆抗体可显著抑制IGF-Ⅱ诱导的Siha细胞p42/44MAPK磷酸化。结论IGF-II可激活宫颈癌SiHa细胞株p42/44MAPK信号通路,并可能通过p42/44MAPK信号通路调控SiHa细胞增殖。

抑制c-Abl激酶调节桩蛋白酪氨酸磷酸化对通气损伤活体大鼠的保护效应

目的 探讨在活体机械通气损伤模型抑制c-Abl激酶是否可以减少桩蛋白酪氨酸残基位点Y31和Y118（Pxn Y31、Pxn Y118）磷酸化,从而阻断其下游效应分子血管内皮-钙黏蛋白（VE-cad）及Rho/Rho激酶活化所致的血管屏障功能紊乱.方法 90只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为9组,每组10只.假手术（Sham）组仅进行气管切开;保护性通气1 h、2 h组（PVT 1h、2h组）潮气量（VT）为6 mL/kg,呼气末正压（PEEP）为5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）;大VT通气1 h、2 h组（HVT 1h、2h组）VT为30 mL/kg,PEEP为0;p42/44丝裂素活化蛋白激酶（p42/44MAPK）抑制剂UO126和c-Abl激酶抑制剂AG957预处理1 h、2 h组分别于大VT通气前1 h腹腔注射UO1261 mg/kg或灌胃AG95710 mg/kg.各组于预定实验时间结束后处死大鼠,采集肺组织标本及支气管肺泡灌洗液（BALF）,用伊文思蓝（EB）实验检测肺血管渗透性,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BALF中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平;镜下观察肺组织病理学改变,并计算弥漫性肺泡损伤系统（DAD）评分,计算肺湿/干重（W/D）比值;用比色法测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性,用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测肺组织c-Abl Y245、Pxn Y31、Pxn Y118、VE-cad Y658、p42/44MAPK Y202/Y204、肌球蛋白轻链（MLC）及肌球蛋白磷酸酯酶目标亚基Y696（MYPT Y696）的磷酸化情况.结果 ①Sham组与PVT组肺组织无明显病理学改变,且两组间各指标均无明显差异;HVT组肺组织损伤严重,且DAD评分、肺W/D比值、EB渗出量、MPO活性和BALF中TNF-α 水平较Sham组及PVT组明显升高;给予AG957或UO126预处理后,上述指标均较HVT组明显降低.②HVT组肺组织各蛋白磷酸化水平较Sham组和PVT组明显增加,以2 h更明显;给予AG957预处理后2 h,肺组织蛋白磷酸化水平均较HVT组明显降低〔p-c-Abl Y245（灰度值）：0.29±0.04比0.42±0.04,p-Pxn Y31（灰度值）：0.51±0.03比0.70±0.05,p-Pxn Y118（灰度值）：0.65±0.04比0.91±0.04,p-VE-cad Y658（灰度值）：0.77±0.07比1.32±0.07,p-p42/44MAPK Y202/Y204（灰度值）：0.38±0.06比0.61±0.03,p-MLC（灰度值）：0.37±0.04比0.77±0.05,p-MYPT Y696（灰度值）：0.54±0.05比0.87±0.06,均P〈0.05〕;给予UO126预处理后2 h,肺组织p-VE-cad Y658表达较HVT组明显降低（灰度值：0.74±0.04比1.32±0.07）,且p42/44MAPK及其下游效应分子MLC、MYPT的磷酸化水平亦明显降低〔p-p42/44MAPK Y202/Y204（灰度值）：0.38±0.07比0.61±0.03,p-MLC（灰度值）：0.37±0.04比0.77±0.05,p-MYPT Y696（灰度值）：0.55±0.05比0.87±0.06,均P〈0.05〕.结论 抑制c-Abl激酶可阻断Pxn Y31、Pxn Y118磷酸化,稳定黏附连接处的VE-cad,并有可能通过阻断Pxn-鸟嘌呤核苷酸交换因子H1（GEF-H1）-p42/44MAPK信号小体的形成而抑制Rho信号链的活化、MLC的磷酸化及继发的肺血管屏障渗透性增加.