响应槲皮素诱导的美国白蛾P450基因及CYP6ZB2功能分析

【目的】明确美国白蛾(Hyphantria cunea)响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系,探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应,以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据,从中筛选显著差异表达的P450基因,应用MEGA X软件对5个P450基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析;通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度(0.5%、1.0%、2.0%和4.0%)处理下的表达模式;克隆CYP6ZB2全长cDNA序列,利用RNA干扰(RNAi)技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因,经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2(GenBank登录号:ON032363—ON032367)。系统发育分析表明,这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明,P450基因响应槲皮素胁迫具有显著的剂量效应,CYP4G297、CYP304F33、CYP333A30和CYP4G296的表达均被不同浓度槲皮素抑制,CYP6ZB2的表达在0.5%—2.0%的槲皮素诱导下显著上调,而在4.0%的槲皮素浓度下被显著抑制。克隆CYP6ZB2的全长cDNA序列,CYP6ZB2具有完整的开放阅读框(ORF),编码500个氨基酸。RNAi结果表明,注射两种剂量(500和1 000 ng)ds CYP6ZB2均可显著抑制CYP6ZB2的表达,注射1 000 ng ds CYP6ZB2 48 h后干扰效率达到最高(96.9%)。CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫经0.5%槲皮素处理后体重增长量低于对照组,存活率(53.33%)分别为未处理组的61.5%和注射双蒸水组的72.7%(P<0.05)。【结论】筛选鉴定到美国白蛾响应槲皮素诱导的5个P450基因,槲皮素对5个基因的诱导表达具有明显的剂量效应,说明不同的P450基因对槲皮素的响应模式存在差异。RNAi能高效沉默CYP6ZB2,0.5%槲皮素对CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫的生长发育具有一定抑制作用,表明CYP6ZB2在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中发挥着重要作用。

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE2的分子克隆与序列分析

为了在分子水平上研究家蚕(Bom byx mori)细胞色素P450基因的特性,更好地探讨该基因与家蚕抗性的相关机制,依据已有的家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择与抗性相关的6家族中含有预测基因数量最多的CYP6AE亚家族的1条序列,并设计1对引物,用RT-PCR方法克隆了家蚕细胞色素P450家族基因CYP6AE2(Gen-Bank登陆号:EF415296)。该基因的ORF为1 572 bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为60.2 kD,等电点为8.50。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,结果表明该基因只有1个内含子;与已知的同亚家族基因CYP6AE1(欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella)、CYP6AE12(棉铃虫Helicoverpa armigera)编码的氨基酸序列比对,同源性同为53%。

家蚕蜕皮激素合成相关的细胞色素P450基因的鉴定分析

【目的】昆虫变态发育的启动主要受前胸腺合成分泌的蜕皮激素所调控,而蜕皮激素的合成是由细胞色素P450基因催化完成。家蚕(Bombyx mori)是一种产丝昆虫,蚕业生产中如果能阻断或延迟家蚕蛹变态发育进程,将有利于改进蚕茧处理工艺,提高蚕丝品质。论文旨在鉴定参与家蚕蜕皮激素合成的细胞色素P450基因,从而为人为遗传调节家蚕变态发育提供靶基因。【方法】基于序列同源性比对,筛选家蚕及其他昆虫中参与蜕皮激素合成的P450基因。利用ClustalW软件,分析昆虫蜕皮激素合成相关P450基因的遗传发生关系。通过全基因组表达芯片数据分析及RT-PCR验证,调查家蚕蜕皮激素合成相关P450基因的时空表达特征。利用RNAi技术分析Cyp314a1表达下调对家蚕变态发育的影响。【结果】家蚕基因组中有4个参与家蚕蜕皮激素合成的P450基因,即Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1和Cyp314a1。比较分析显示,这4个蜕皮激素合成相关的P450基因在家蚕及其他昆虫中都是单拷贝,而且每个基因的同源体在遗传发生树上能很好地聚成一类,表明昆虫蜕皮激素合成相关的P450基因及其负责的蜕皮激素合成通路非常保守。时空表达谱分析显示,在家蚕幼虫5龄第3天,Cyp302a1、Cyp315a1和Cyp314a1主要在家蚕幼虫卵巢、精巢和头部等组织器官中高表达;在幼虫-蛹-成虫变态发育进程中,Cyp302a1、Cyp315a1和Cyp314a1主要在蛹变态发育后期表达,其中Cyp314a1分别在上簇、化蛹及羽化前高表达,这与蜕皮激素滴度高峰出现的时期基本一致。Cyp314a1的RNAi导致家蚕不能正常化蛹及雌蛾卵巢发育异常,且降低了蜕皮激素信号通路关键基因HR3及Ftz-f1的表达。【结论】家蚕蜕皮激素合成相关的P450基因在进化上非常保守,其表达水平降低能引起家蚕蛹变态发育受阻,暗示蜕皮激素合成相关P450基因可以用作家蚕变态发育控制的靶标基因之一。

水稻P450基因Oscyp71Z2增强稻瘟病抗性的机制

【目的】分析水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在稻瘟病抗性中的作用,并解析其介导的水稻抗稻瘟病机制。【方法】根据高抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12表达谱结果,筛选到一个表达量高达114.6倍的细胞色素P450基因Oscyp71Z2(NCBI登录号:Os07g0217600)。根据Oscyp71Z2全长编码区序列设计引物,以水稻模式粳稻品种日本晴的cDNA为模板,通过PCR扩增Oscyp71Z2全长编码区序列。将所得的cDNA序列经测序后,与双元表达载体pVec8连接,构建超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2。采用冻融法将构建的超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2质粒转入农杆菌菌株EHA105,并利用农杆菌转化法获得Oscyp71Z2超表达水稻。常规PCR技术检测T4代Oscyp71Z2超量表达水稻中选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因(hygromycin phosphotransferase gene,hph),并通过qRT-PCR检测超量表达水稻中目的基因Oscyp71Z2的表达量。进一步对阳性超量表达水稻(T4、T5和T6)进行稻瘟病表型鉴定,并检测植保素含量变化(T4)。【结果】RT-PCR和qRT-PCR结果显示,水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在高抗稻瘟病的转hrf1水稻中有较高的表达,与表达谱数据一致。通过生物信息学分析Oscyp71Z2全长1 554 bp,含有2个细胞色素P450保守结构域,是CYP71Z2亚家族成员。将Oscyp71Z2成功连接到双元载体pVec8,利用农杆菌介导法获得Oscyp71Z2超量表达水稻。超量表达水稻株系在各生育期、株高等性状,与非转基因水稻日本晴基本一致。超量表达株系中Oscyp71Z2的表达量较野生型有显著升高。超量表达水稻的穗颈瘟抗性等级维持在1—2级,表现为抗病或者中抗,而野生型水稻的穗颈瘟等级为3—4级,表现为感病,Oscyp71Z2在水稻中超量表达显著增强了对穗颈瘟的抗性。Oscyp71Z2超量表达株系每克新鲜叶片中植保素MA和PB含量平均是328和124 ng,相对于野生型的85和42 ng·g-1新鲜叶片有显著升高。Oscyp71Z2超量表达株系中涉及到植保素MA和PB合成通路的4个关键基因的表达量较野生型有显著地升高。【结论】水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2通过调控植保素生物合成通路,赋予水稻稻瘟病抗性。

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因:CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1569bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1590bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得)6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明:CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。

玉米螟P450基因cDNA的克隆及植物次生物质对其诱导表达

昆虫细胞色素P450是一类在生物代谢中起重要作用的基因家族,承担着许多重要的生理功能,包括对植物次生物质代谢和杀虫剂解毒等.本研究以玉米螟5龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据不同昆虫P450基因家族保守氨基酸序列,设计并合成简并引物,利用RT-PCR扩增出了玉米螟细胞色素P450基因cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体进行序列测定.测序获得了编码213个氨基酸残基的641 bp的DNA片段,命名为OfP450(GenBank登录号:EU807990);与已公布的棉铃虫、家蚕、欧洲防风草结网毛虫、小菜蛾和黑腹果蝇等的细胞色素P450氨基酸序列进行比较,其一致性分别为55%、50%、49%、44%和31%.将植物次生物质棉酚、丁布添加入人工饲料中,对玉米螟进行了饲喂实验,采用优化半定量RT-PCR,以18SrRNA为内标,RT-PCR检测进食棉酚、丁布植物化合物的玉米螟中肠P450基因的转录.结果表明,其转录水平能被棉酚、丁布显著诱导.提示本实验克隆的玉米螟细胞色素P450对植物次生物质的代谢作用与P450表达量呈正相关.该研究为下一步将植物介导的RNA干扰技术应用于害虫生物防治提供坚实的基础.

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1512bp,编码504个氨基酸;CYP4S9编码区长1473bp,编码491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。

刺五加P450基因时空表达差异及与皂苷含量的相关性分析

为探明刺五加P450基因的表达特点及其与刺五加总皂苷含量的相关性,利用实时定量PCR技术分析了刺五加P450基因在不同产地、不同器官、不同发育时期以及茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)处理后的表达规律,及其与刺五加总皂苷含量的相关性。结果表明:刺五加的P450基因在各器官均有表达,但表达量差异极显著(P<0.01)。刺五加的P450基因在盛花期表达量最高,果实快速生长期最低。MeJA处理可显著影响P450基因的表达量(P<0.05)。P450基因的表达量与总皂苷含量间存在极显著的正相关关系(P<0.01),P450基因的表达量决定了刺五加总皂苷的含量。

橘全爪螨对双甲脒的抗性选育及其P450基因的表达差异分析

为了对双甲脒进行抗性风险评估,弄清P450基因在橘全爪螨Panonychus citri抗药性中的作用,在室内用双甲脒对橘全爪螨进行了抗性选育和交互抗性研究,同时分析了橘全爪螨双甲脒抗性和敏感品系P450基因表达差异。经过12代抗性选育,获得了橘全爪螨双甲脒抗性品系,与敏感品系比较,橘全爪螨对双甲脒的抗性倍数达到26.32倍。抗性风险评估表明,橘全爪螨对双甲脒抗性遗传力h2为0.148。螺螨酯、丁醚脲、炔螨特和三唑锡对抗性品系的LC50分别为敏感品系的16.85,4.98,2.13和2.05倍,表明双甲脒抗性品系对螺螨酯、丁醚脲、炔螨特和三唑锡具有明显的交互抗性。阿维菌素、苯丁锡、哒螨灵、矿物油对抗性品系LC50分别为敏感品系的1.10,1.21,0.67和0.99倍,表明双甲脒抗性品系对上述4种药剂没有显著的交互抗性。基因差异性分析发现,抗性品系中有16条P450基因发生了上调,27条P450基因发生了下调,其中CYP389A6上调倍数最高[log2ratio(RS/SS)=11.526],CYP389A2下调倍数最高[log2ratio(RS/SS)=-12.683],由此推断,CYP389A6上调和CYP389A2下调可能是橘全爪螨对双甲脒产生抗性的重要原因。

植物细胞色素P450基因的异源表达系统研究进展

细胞色素P45 0氧化酶是一类具有多种催化功能含血红素的氧化酶系。由于参与多种类型的氧化反应 ,在植物生命活动中有重要功能 ,其研究一直受到重视。自 1 990年第一个植物P45 0基因成功克隆以来 ,到 2 0 0 2年年底 ,已有 60 0多个P45 0基因被克隆 ,有 1 0 0多个基因在细菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞等异源表达系统中成功表达并鉴定了功能。拟对植物P45 0的大肠杆菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞表达系统的特点进行比较 ,对在各表达系统中成功表达并进行了功能鉴定的植物P45 0进行归纳 ,并对目前植物P45 0异源表达的现状和应用进行概述。

新型通用探针LDR分型技术的开发及细胞色素P450基因多位点分型

构建了一种可同时对多个位点进行基因分型的新型通用探针连接酶检测方案．与普通的连接酶检测方案相似．具有灵敏度高和特异性强的特点．但降低了50％～90％的探针设计与合成成本。利用该方案对115例正常中国人的细胞色素P450系统的6个位点进行基因分型．样本测序与基因频率的统计学分析验证了该方案准确可靠。

家蚕P450基因CYP305B1的基因组序列克隆及结构分析

为了研究家蚕P450基因CYP305B1的结构,采用反向PCR技术克隆了家蚕CYP305B1基因的基因组序列,经序列测定,拼接得到家蚕CYP305B1全基因序列,发现家蚕CYP305B1的第1内含子位于5′端非翻译区序列(5′-UTR)中间。将家蚕CYP305B1与野桑蚕P450基因CYP305B1V1序列进行同源性比较的结果表明,二者在5′-UTR上游-400～-770 bp序列间的同源性只有40.4%,序列差异最大的是第1内含子和第6内含子。在第1内含子中,野桑蚕CYP305B1V1在翻译起始密码ATG上游-340之前存在330 bp的插入序列,在-110～-340 bp间二者的同源性也只有46.9%;在第6内含子中,家蚕CYP305B1比野桑蚕CYP305B1V1多了一段约300 bp的插入序列。研究结果有助于进一步探究该基因的转录和调控机制。

安徽地区绝经后妇女细胞色素P450基因CYP17多态性与骨密度及血脂相关性研究

目的了解安徽地区汉族绝经后女性的P450基因CYP17多态性分布与骨密度及血脂的相关性。方法随机选择194名安徽合肥地区健康汉族绝经后妇女,运用双能X线骨密度吸收法测定腰椎L2-L4和股骨近端部位的骨密度(BMD),并采用聚合酶链反应—?限制性片断长度多态性方法对P450基因的CYP17多态性位点进行基因分析。测定血甘油三酯(TG)总胆固醇(TC),低密度脂蛋白(LDL)。结果①CYP17基因型分布频率依次为TC型,CC型,TT型;②CYP17位点TC型Ward s三角区BMD明显高于CC型(P<0.05),与腰椎以及股骨颈和大转子区BMD无关(P>0.05)。在调整年龄、身高、体重、BMI、绝经年限等因素后,CYP17多态位点与Ward s三角区BMD显著相关(P<0.05)。③血TC与股骨颈BMD呈负相关(r=-0.210,P=0.015),LDL与腰椎BMD呈显著负相关(r=-0.225,P=0.009),TG与股骨颈BMD呈显著负相关(r=-0.275,P=0.001),与Ward s三角区BMD呈负相关(r=-0.174,P=0.043)。各基因型间血脂水平无差异(P>0.05)。结论①安徽地区绝经后女性P450基因CYP17多态性位点与绝经后女性Ward s三角区BMD有相关性;②血TC、LDL、TG升高可能是绝经后女性骨质疏松发生的危险因素;③未发现P450基因CYP17多态性位点与安徽地区绝经后女性血脂水平有相关性。

家蝇抗性相关P450基因的初步研究

为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇的 P4 50基因的特性 ,更好地研究其与抗性相关的机制 ,本研究根据在美洲地区的抗性家蝇品系 ( LPR)克隆的 P4 50基因 MDC YP6D1的保守序列设计合成引物 ,用 PCR方法从北京地区的家蝇中也扩增出 1条约 2 1 0 bp的特异性片段 ,片段长度与原序列对应片段相近 ,说明北京地区的家蝇 P4 50基因与 MDCYP6D1间有很大的同源性。H inf I酶切发现扩增产物上并没有相应的酶切位点 ,说明扩增产物与原序列 MDCYP6D1的相应部分不一样 ,提示这一用 PCR方法在北京地区的家蝇中扩增出的 P4 50基因片段有可能对应一新的 P4 50基因。 PCR-SSCP结果显示扩增产物在一级结构上有一定的多态性 ,这一现象可能与 P4

寄生蜂细胞色素P450基因家族进化分析

寄生蜂是重要的天敌昆虫,被广泛应用于生物防治,但在实际生产应用中面临诸多问题,如环境适应性和耐药性问题。细胞色素P450是真核生物中广泛存在的超基因家族酶系,参与农药、植物次生代谢物及环境有害物质等的代谢,同时也参与昆虫体内多种内源性化合物的合成与代谢。本文通过对植食性榕小蜂和9种寄生蜂基因组数据的生物信息学分析,共获得615个P450基因,分析表明不同寄生蜂P450基因家族的差异主要发生在CYP3和CYP4簇,而CYP2和Mito簇相对保守;相较于外寄生蜂,内寄生蜂的P450超基因家族有明显的收缩现象;此外,发现了2个在寄生蜂中1:1:1高度保守的P450基因,CYP18和CYP314,以及茧蜂特有的CYP304基因和内寄生蜂特有的CYP28基因。本研究从基因组水平系统地分析了寄生蜂P450超基因家族的进化,为寄生蜂的遗传改良和规模化饲养等提供理论基础。

大草蛉P450基因cDNA片段的克隆及吡虫啉诱导表达

本研究根据不同昆虫细胞色素单加氧酶P450基因CYP4基因家族保守氨基酸序列,设计简并引物,通过RT-PCR扩增出了大草蛉Chrysopa septempunctata P450基因417 bp cDNA片段,命名为CSP450。该片段编码138个氨基酸残基,与已公布的烟草天蛾Manduca sexta、赤拟谷盗Tribolium castaneum、嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila、玉米夜蛾Laphygma exigua、家蚕Bombyx mori、不吉按蚊Anopheles funestus和红火蚁Solenopsis invicta的CYP4 P450氨基酸序列进行比对,其相似性分别为59%、59%、54%、54%、58%、54%、54%。研究表明,用1 mg/L的吡虫啉溶液对大草蛉幼虫进行诱导,实时荧光定量PCR技术检测大草蛉体内CSP450基因的转录表达呈上调趋势,推测该基因可能参与了大草蛉体内吡虫啉的分解代谢过程。

AzaC预处理增加TCDD对特殊细胞P450基因的诱导

利用RT-PCR检测不同物质诱导细胞的CYP基因 mRNA的表达水平.在HepG2细胞,TCDD能诱导CYP1A1、CYP1B1及CYP1A2基因表达,CYP1A1、CYP1B1基因比CYP1A2基因更容易被诱导,用AzaC处理后CYP1B1基因表达无改变;在A549细胞和SPC-A1细胞,Azac预处理后增加了TCDD对CYP1家族的诱导.也就是AzaC增加了CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1基因表达水平.

水稻细胞色素P450基因OsDWARF48调控株高的功能分析

本研究以水稻中花11为材料克隆了一个P450家族基因,命名为OsDWARF48。该基因在水稻中为组成型表达,在幼胚中的表达量最高;并且其表达受到BR的抑制。进一步以获得的基因过表达及反义转基因植株为材料,对株高进行测量,结果显示,OsDWARF48反义转基因株系株高明显矮于对照,而过表达转基因株系OE3株高明显高于对照。通过对水稻内源生长素、油菜素内酯和赤霉素的含量测定,发现3种激素在反义转基因株系中含量均下降,在过表达转基因株系OE3中含量均上升,表明OsDWARF48通过调控BR合成及信号转导途径,进而与GA和IAA协同作用调控水稻株高。

小菜蛾细胞色素P450基因的cDNA片段克隆及其序列分析

以小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]3龄幼虫(对氰戊菊酯的LC50为38.75 mg/L)的总RNA为模板,利用简并引物,采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)方法扩增出1个长度为240 bp的cDNA片段。序列分析结果表明,扩增出的cDNA片段与细胞色素P450的Cyp6基因有较高的同源性。