猪肺炎支原体168弱毒株P46基因的克隆和鉴定

猪肺炎支原体的表面抗原基因 Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应，其分子量约４６ ｋ Ｄａ。根据 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 公布的 Ｐ４６基因序列设计１对能扩增 １ ３７７ ｂｐ Ｐ４６结构基因的引物（５： Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ，３： Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ）作 Ｐ Ｃ Ｒ，成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出目的基因。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９质粒中，部分测序表明克隆基因与 Ｊ株基因同源性达９６％ 。其变异主要表现为 Ａ 碱基缺失或变为 Ｃ碱基；人工致弱株外显子基因中 Ａ、 Ｔ 碱基较 Ｇ、 Ｃ可能有更高的易变性。

广西陆川猪肺炎支原体P46基因克隆及序列分析

为了解广西陆川猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的主要免疫原性表面蛋白基因P46的序列特征、基本结构及遗传变异等特点，试验以2011至2013年广西纯种陆川猪疑似猪支原体肺炎（MPS）阳性病料为研究对象，抽提DNA进行PCR扩增，将克隆出与目的基因大小相符的片段回收，再与载体连接，转化到大肠杆菌DH5“感受态细胞中，筛选阳性克隆及测序，扩增获得4株Mhp毒株（GXLC1、GXLC2、GXLC3和GXLC4），随后用DNAStar软件对P46基因序列进行比对分析。结果表明，已克隆出的P46基因序列长度为1104bp，编码368个氨基酸，其中该序列中含有3个编码色氨酸的TGA密码子，而不是终止密码子；1个CGG为编码精氨酸的稀有密码子，而不是其他支原体中的无义密码子。所获得的4株Mhp毒株的P46基因序列与所参考的MhpJ株、232株、7448株及168株的核苷酸同源性为98．4％～99．4％，氨基酸同源性为98．6％～99．5％，毒株之间P46基因的同源性很高，保守性较强。

猪肺炎支原体表面蛋白P46基因的克隆与序列比较

猪肺炎支原体 (MycoplasmaHyopneumoniae ,Mhp)兔化弱毒株R6 5 9株、济南强毒株、强毒Z株、国际标准株2 32 ,通过A2 6培养基培养 ,提取DNA ;利用PCR技术从四株猪肺炎支原体中均能扩增出目的条带。将该序列克隆到pGEM_T_Easy载体上测序。结果表明 ,克隆序列全长 115 2bp ,编码 383个氨基酸和一个终止子 (TAA) ;该序列中含有 3个TGA编码Trp ,而不是终止密码子。比较兔化弱毒株与济南强毒株、国际标准株 2 32及NCBI上发布的J株的P4 6基因序列 ,发现它们的同源性分别为 98 6 %、99 2 %、99 2 % ;比较它们编码的氨基酸发现它们的同源性分别为 98 7%、99 2 %、99 2 %。结果表明猪肺炎支原体的P4 6基因在猪肺炎支原体种内是很保守的 ,因此建立以P4 6蛋白为诊断抗原的ELISA具有潜在的意义。

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的 对旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。 方法 利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET 2 8a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析表达产物。 结果 SDS PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 480 0 0 ,与理论值相符。ELISA和Westernblotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 460 0 0蛋白。 结论 成功表达了旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。

猪肺炎支原体MY-99株P46基因的序列分析

提取猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)MY-99株DNA,利用设计的一对引物扩增编码P46蛋白的基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体,挑取2个克隆株测序。测序结果表明,P46基因全长1134 bp,编码378个氨基酸,序列的182、381和734位有3个TGA,是编码色氨酸Trp的密码子。2个克隆株的测序结果与标准株232株的P46基因序列相比,其同源性分别为99.6%和99.2%。

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

猪肺炎支原体西昌分离株16S rRNA和P46部分基因的克隆与序列分析

为了解西昌猪肺炎支原体的遗传变异情况,对西昌市Mhp分离株XC01的16S rRNA和P46基因部分序列进行PCR扩增和序列分析,并构建NJ树。结果显示,XC01的16S rRNA和P46基因片段的长度分别为1 146 bp和1 059 bp,与Mhp参考株的核苷酸序列同源性分别为97.5%~99.8%和98.6%~99.4%;构建的NJ树显示不同地方的Mhp株未形成明显的地理分支。结果表明,Mhp分离株的16S rRNA和P46基因序列高度保守,在遗传演化中未发生太大的变化。研究结果为猪肺炎支原体的分子遗传变异研究和开展分子流行病学调查提供参考依据。

猪肺炎支原体P46基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体J株P46基因序列设计一对引物,扩增得到P46全基因序列,将克隆得到的P46基因片段克隆至pEasy-T载体中进行测定。将SC株P46基因与232株、J株、7448株及168株进行比对,结果表明SC株与这些株同源性分别为99.9%、99.6%、99.2%、99.0%。

猪肺炎支原体SC株P46基因的定点突变

猪肺炎支原体P46基因中有3个密码子TGA用于编码Trp而非终止密码子,为了在原核表达系统中进行猪肺炎支原体P46基因的根表达,根据其序列设计了3对引物,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法将编码密码子TGA同义突变为TGG。将突变后的P46基因克隆至pEasy-T载体中,并进行测序。测序结果表明将P46基因中的TGA密码子突变为TGG很成功。

猪肺炎支原体168弱毒株P46-P65融合蛋白的免疫原性

根据猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株p46和p65基因序列设计特异性引物,进行PCR扩增并构建表达载体pET-28a-p46,pET-28a-p65以及pET-28a-p46-p65。以表达载体pET-28a-p46和pET-28a-p46-p65为模板,将其中p46基因3个TGA密码子突变为TGG。原核表达并纯化的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。分别选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA试验证明单蛋白P46、P65以及融合蛋白P46-P65的血清效价分别为:1∶1 280000,1∶128 000和1∶2 560 000;攻毒试验证明,P46、P65单蛋白和P46-P65融合蛋白疫苗的保护率分别可达82%,78%和98%。融合蛋白P46-P65具有良好的免疫原性,并且要优于单蛋白P46和P65的免疫原性。

贵州省地方猪肺炎支原体鉴定及其主要黏附因子基因序列分析

为了了解贵州地方猪肺炎支原体菌株遗传变异情况,试验对3份贵州省贵阳市某地方猪养殖场疑似感染猪肺炎支原体的病料进行离体培养及PCR鉴定;同时对分离菌株及6株疫苗菌株的主要黏附因子P46基因、P97基因R1区和P146基因高变区进行PCR扩增及测序,并与参考菌株比对分析,挖掘分离菌株与疫苗菌株、参考菌株之间的差异性。结果表明:从疑似病料中培养并鉴定获得1株猪肺炎支原体,命名为GZ株。GZ株P46基因核苷酸序列与疫苗菌株、参考菌株的同源性最高,均在98.3%以上。P146蛋白高变区氨基酸差异主要发生在PQ和PS重复区,GZ株PQ重复区中只缺失2个氨基酸,而PS重复区中缺失7个氨基酸,与疫苗菌株168L株、RM48株和Z株缺失情况一致。GZ株P97基因R1区核苷酸序列与疫苗菌株、参考菌株之间的同源性低,为94.5%~97.4%;各菌株间P97蛋白R1区氨基酸序列中,AAKPV/E重复基元存在不同程度缺失,GZ株在该区域仅存在5个重复基元,且第1个重复序列中的谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)。说明P97蛋白R1区和P146蛋白高变区氨基酸序列的改变导致抗原表位和黏附能力发生变化,对P97基因R1区和P146基因高变区遗传变异情况的调查将有助于筛选出最佳商品化疫苗和研制地方性适用疫苗,有效阻止肺炎支原体在猪群中的传播。