猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

猪肺炎支原体P46基因的原核表达与间接ELISA方法的建立

猪肺炎支原体是猪喘气病的病原体,本研究选择猪肺炎支原体P46膜蛋白基因亲水区序列进行克隆,并将其内3个编码Trp的TGA突变成TGG,然后再克隆到pET28a(+)载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现了高效表达,表达产物相对分子质量约为31ku,约占菌体总蛋白35%,表达形式为包涵体,通过Western blotting证明表达产物与猪肺炎支原体高免血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的猪肺炎支原体P46重组蛋白经过洗涤、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原用于检测猪血清中猪肺炎支原体抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了rP46-ELISA方法,获得了较好的效果,通过与现有ELISA检测方法的比较,结果表明二者间具有较高的符合率。

猪肺炎支原体膜蛋白P46基因在大肠杆菌中的表达

把猪肺炎支原体 (Mycoplasmahyopneumoniae) 国际标准株 2 32的P4 6基因克隆进pGEM_T_EASY载体上 ,通过PCR方法把该基因中三个编码Trp的密码子TGA突变为TGG ,然后将该基因亚克隆到载体pMAL_P2X上 ,得到重组表达载体 pMAL_P2X_P4 6。用该重组载体转化大肠杆菌TB1,得到表达重组菌TB1_pMAL_P2XA_P4 6 ,用终浓度为 0 3mM的IPTG在 37℃下诱导表达 ,获得可溶性表达的融合蛋白MBP_P4 6 ,在免疫印迹试验中 ,兔抗MBP高免血清和兔抗猪肺炎支原体高免血清都能与目的蛋白发生阳性反应 ,证明猪肺炎支原体P4 6基因在大肠杆菌里获得了可溶性表达。

重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基优化和高密度发酵

为提高重组蛋白的生产效率,利用响应面试验设计技术,对表达猪肺炎支原体P46蛋白的重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基进行了优化,确定了培养基各营养成分及其最佳配比。在相同培养条件下,优化培养基比LB培养基的菌体浓度高出一倍。在生物反应器中利用优化培养基发酵培养该重组大肠杆菌,培养物的湿菌重达39.5 g/L。SDS-PAGE电泳结果显示,高密度发酵对重组大肠杆菌DE-pET-P46的rP46的表达和占细胞总蛋白比例均没有明显的改变。

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

猪肺炎支原体JM株的分离鉴定及主要抗原蛋白基因序列分析

为了对从广东地区若干个屠宰场采集的164份疑似猪肺炎支原体感染的猪肺脏组织进行猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHp)的分离鉴定,并了解其主要抗原蛋白基因的遗传变异特点,试验先对采集的肺脏组织进行16S rRNA基因PCR检测,阳性样本进行病原的分离培养、形态学观察、双重PCR鉴定、分离株主要抗原蛋白膜蛋白P46全基因与黏附蛋白P97基因R1R2区序列分析及效价的测定。结果表明:164份临床样本经16S rRNA鉴定后102份为MHp阳性,阳性率为62.2%;阳性样本接种江苏二号(KM)液体培养基生长良好,颜色呈规律性变黄,在固体培养基上均能呈现特异性菌落形态;各代次分离菌株经16S rRNA双重PCR鉴定均能获得3个大小约1000 bp的目的条带,测序结果与国内外MHp各参考株核苷酸相似性为96.42%~98.21%,说明3株分离株均属于MHp,且可稳定遗传,分别命名为JM-24、JM-39、JM-44,分离株生长效价可达1×10CCU/mL;3株分离株主要抗原蛋白P46全基因和P97基因R1R2区与各参考株核苷酸相似性分别为96.0%~99.3%、97.8%~99.1%,其中P46全基因与参考株核苷酸同源性最高的为ES-2L株(登录号为CP058578.1),最低的为168株(登录号为CP002274.1)、168-L株(登录号为CP003131.1)、GDZJ01株(登录号为KF032627.1);P97基因R1R2区与参考株核苷酸同源性最高的为F7.2C株(登录号为CP034597.1),同源性最低的为168/GDZJ01株,P97基因R1R2区与国内外各致病菌株演绎的氨基酸序列同源性为72.3%~96.9%,其中分离株JM-44氨基酸序列在128~150位点存在缺失或变异,P46基因与P97基因R1R2区系统发育分析结果均表明JM-44分离株与国内外标准株及疫苗株(J株/168株)亲缘关系较远。说明我国广东地区MHp流行株与目前市场疫苗流行株遗传变异较大,提示现有疫苗对猪支原体肺炎的保护率可能下降。

猪肺炎支原体168弱毒株P46-P65融合蛋白的免疫原性

根据猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株p46和p65基因序列设计特异性引物,进行PCR扩增并构建表达载体pET-28a-p46,pET-28a-p65以及pET-28a-p46-p65。以表达载体pET-28a-p46和pET-28a-p46-p65为模板,将其中p46基因3个TGA密码子突变为TGG。原核表达并纯化的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。分别选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA试验证明单蛋白P46、P65以及融合蛋白P46-P65的血清效价分别为:1∶1 280000,1∶128 000和1∶2 560 000;攻毒试验证明,P46、P65单蛋白和P46-P65融合蛋白疫苗的保护率分别可达82%,78%和98%。融合蛋白P46-P65具有良好的免疫原性,并且要优于单蛋白P46和P65的免疫原性。