p47^phox基因第10外显子多态性与脑卒中的关联及其对血脂的影响

目的探讨p47^phox 基因第10外显子C923T（Ala308Val）多态性与湖南地区汉族人群脑卒中的关联及其对血脂的影响。方法采用PCR-单链构象多态技术和DNA直接测序法检测湖南地区汉族220例脑卒中患者、20个脑卒中家系成员和100名健康对照者的p47衄基因第10外显子C923T（Ala30SVal）多态性；酶法测定总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇；免疫比浊法测定apoA-I及apoBl00；ELISA法测定血清脂蛋白α水平。结果湖南省汉族人炉基因第10外显子C923T（Ala30SVal）多态存在CC、CT、TT 3种基因型,脑卒中组及其各亚型组C923T（Ala308Val）多态基因频率分布与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；分析不同基因型对血脂、脂蛋白水平的影响，发现脑梗死组和对照组CT基因型血清甘油三酯水平均明显高于CC基因型（P〈0．05）。结论湖南省汉族人群p47^phox基因C923T（Ala308Val）多态性可能与脑卒中的易患性无关联，可能与脑梗死患者血脂代谢相关。

P47^(phox)基因第4外显子多态性与湖南省汉族人群脑梗死的相关研究

目的探讨P47^(phox)基因第4外显子G338A(Arg90His)和G457A(Thr129Thr)多态性与湖南省汉族人群脑梗死的相关性。方法采用PCR-单链构象多态技术和DNA直接测序法检测湖南省汉族人群散发性脑梗死患者110例、10个脑梗死家系成员110例及100例健康对照组的P47^(phox)基因第4外显子G338A和G457A多态性。酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),免疫比浊法测定apo A-I及apo B100,ELISA法测定Lp(a)血清水平。结果 p47^(phox)基因第4外显子G338A多态存在GG、GA和AA 3种基因型,脑梗死组及其各亚型组G338A多态A等位基因频率分布与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);G457A多态存在GG和GA两种基因型,脑梗死组及其各亚型组G457A多态基因频率分布与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);脑梗死组及其各亚型组血清TC、TG、LDL-c及Lp(a)水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);组内不同基因型间血脂、脂蛋白水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 p47^(phox)基因G338A多态A等位基因可能是脑梗死,特别是有高血压病性和糖尿病性脑梗死患者的一个危险因素;G457A多态可能与脑梗死的发病无关。p47^(phox)基因G338A和G457A多态性与血脂代谢可能有关。

大鼠局灶性脑缺血再灌注脑内p47^(phox)表达变化的研究

目的通过观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后p47phox基因在脑内表达动态变化,探讨p47phox在局灶性脑缺血再灌注后对脑缺血损害的作用及机制,可能为p47phox基因作为脑卒中的候选基因提供理论依据。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑缺血再灌注组和假手术组再灌后第1、3、6、12和24h和正常对照组p47phox基因在脑内的表达。结果正常对照组和假手术组大鼠脑皮质内有少量p47phox mRNA表达,组内各时间点比较无统计学意义(P>0.05);脑缺血再灌注组,缺血再灌注1h后p47phox mRNA表达增加,至3h达高峰(与假手术组和正常对照组相比差异显著,P<0.01)。结论p47phox可能参与了脑缺血再灌注后损伤,并在其中发挥了重要作用。

利多卡因对人离体中性白细胞超氧阴离子和p47^(phox)磷酸化的影响

目的用人离体中性白细胞研究利多卡因对刺激剂诱导超氧阴离子产生,蛋白质酪氨酸磷酸化和NADPH氧化酶组成因子p47phox和p67phox从细胞质向细胞膜移动的影响。方法用细胞色素C还原法测定不同浓度利多卡因对3种刺激剂介导的中性白细胞释放超氧阴离子量。用Western blot检测中性白细胞蛋白质的磷酸化及NADPH氧化酶细胞质因子p47phox和p67phox的磷酸化。结果利多卡因可呈浓度依赖性抑制f MLP(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)介导的中性白细胞释放超氧阴离子,而对PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)或AA(arachidonic acid)介导的中性白细胞释放超氧阴离子并无影响。利多卡因呈浓度依赖性抑制f MLP介导的中性白细胞蛋白质(86.0,58.0,45.0 kDa)的磷酸化,与利多卡因对中性白细胞释放超氧阴离子的影响相一致,另外利多卡因还可抑制细胞质因子p47phox和p67phox的从细胞质向细胞膜的移动,从而抑制NADPH氧化酶释放超氧阴离子。结论利多卡因呈浓度依赖性抑制f MLP介导的中性白细胞产生超氧阴离子,这一作用与抑制细胞的一些蛋白质磷酸化及p47phox和p67phox从细胞质向细胞膜移动有关。

NADPH氧化酶在TNF-α诱导HUVECHO-1表达中的作用

目的探讨NADPH氧化酶来源的活性氧(ROS)在TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血红素氧化酶1(HO-1)表达中的作用。方法用小分子RNA干扰(siRNA)技术消除HUVEC的NADPH氧化酶p47phox亚基,用分子探针2,7-DCF测定细胞内ROS的产生量以及用RT-PCR测定HO-1 mRNA的表达。结果TNF-α(200 U/mL)作用24 h后,HUVEC中ROS的产生量增加了138%,细胞内HO-1 mRNA表达较对照组增加146.5%;转染p47phoxsiRNA后,细胞内NADPH氧化酶p47phox亚基的mRNA表达消失,ROS的产生量降低至对照组水平,而HO-1 mRNA的表达水平降低约54%。结论TNF-α刺激后,HUVEC内产生的ROS主要来源于NADPH氧化酶的活化,但ROS仅部分介导了TNF-α对HO-1基因表达的诱导作用。

MabHIM_(70)对人NpNADPH氧化酶的调节(Ⅱ)

在发现 Mab HIM_(70)对 Np NADPH 氧化酶胞浆组分p47^(phox)、p67^(phox)和 Rac2的表达和参与 NADPH 氧化酶活化均有降调节作用基础上,进一步探索了 Mab HIM_(70)对该降调节作用的机理。发现 Mab HIM_(70)可能对 NADPH 氧化酶上游 PKC、PTK 及 P13K 信号传递途径的活化水平有降调节作用,该单抗对 NADPH 氧化酶活化有降调节的作用可能与此有关。

烟草—TMV相互作用中质膜NADPH氧化酶的组装

比较 Ｎ Ｎ 烟草（与烟草花叶病毒（ Ｔ Ｍ Ｖ）发生非亲和相互作用）和普通烟草 ３００２ 品种（与 Ｔ Ｍ Ｖ 发生亲和相互作用）在烟草— Ｔ Ｍ Ｖ 的相互作用中质膜 Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ 氧化酶的组装激活、产生活性氧的差异．用两相法制备密闭的正向型质膜（ Ｐ Ｍ）囊泡，以 Ｓ Ｏ Ｄ 敏感的 Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ 依赖的 Ｃｙｔ ｃ 的还原表示 Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ 氧化酶的活性，用人类噬中性白细胞 Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ 氧化酶亚基 ｐ４７ｐｈｏｘ 的抗体对烟草叶片蛋白进行免疫学检测．结果显示在两种烟草叶片胞质中均存在与 ｐ４７ｐｈｏｘ 亚基的抗体发生免疫交叉反应的相同分子量的蛋白，该蛋白在 Ｔ Ｍ Ｖ 侵染 Ｎ Ｎ 基因烟草后可向质膜发生转移，且伴随有氧化酶活性的升高．而对于普通烟草则无氧化酶膜组分和酶活性的明显变化．以上结果表明，烟草叶片质膜上存在与哺乳动物 Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈ 氧化酶相类似的氧化酶，它的组装和激活可能是烟草— Ｔ Ｍ Ｖ 非亲和相互作用早期活性氧的主要来源．

2型糖尿病患者外周血NADPH氧化酶表达和超氧阴离子的产生

目的探讨2型糖尿病患者外周血NADPH氧化酶表达及外周血释放超氧阴离子（O2^-）量与糖化血红蛋白（Hb）Alc、糖尿病肾病及糖尿病病程相关性。方法细胞色素C还原法测外周血中性白细胞释放O2^-的水平。Westernblot检测NADPH氧化酶p47-^PHOX和p67-^PHOX因子磷酸化表达。并分析O2^-的水平与其HbAlc、糖尿病肾病及糖尿病病程的关系。结果2型糖尿病患者组外周血中性白细胞NADPH氧化酶p47-^PHOX和p67-^PHOX因子的磷酸化表达较对照组显著增强。2型糖尿病患者组中性白细胞释放O2^-的水平与HbAlc、糖尿病病程正相关（r分别为0．798、0．774，P〈0．01），与糖尿病肾病呈负相关（r为-0．798，P〈0．01）。结论NADPH氧化酶p47-^PHOX和p67-^PHOX因子在糖尿病患者中表达增加。外周血中性白细胞释放O2^-水平与HbAlc、糖尿病病程及与糖尿病肾病存在一定的关系。

同型半胱氨酸对人离体嗜中性白细胞释放超氧阴离子的影响和机制

目的用人离体嗜中性白细胞研究同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)对刺激剂介导的超氧阴离子释放和P47phox磷酸化的影响。方法细胞色素C还原法测定3种刺激剂介导的嗜中性白细胞超氧阴离子释放量。用Westernblot法检测嗜中性白细胞NADPH氧化酶P47phox的磷酸化。结果Hcy呈浓度依赖性促进N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)介导的嗜中性白细胞释放超氧阴离子,不影响佛波豆蔻醚乙酸盐(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)和花生四烯酸(arachi-donicacid,AA)介导的嗜中性白细胞释放超氧阴离子。酪氨酸激酶抑制剂5,7,45-三羟基异黄酮(genistein)可呈明显抑制fMLP介导的氧自由基产生,而蛋白激酶C抑制剂十字孢碱(staurosporine)仅有轻度抑制作用。Hcy刺激fMLP介导的嗜中性白细胞质因子P47phox磷酸化,与其对超氧阴离子释放的影响是一致的。结论Hcy通过激活膜受体,激活P47phox磷酸化,促进中性白细胞释放超氧阴离子。

P47^(phox)基因C923T多态性与脑梗死的相关性研究及其对血脂的影响

目的探讨P47^(phox)基因第10外显子 C923T(Ala308Val)多态性与脑梗死的关系及其对血脂的影响。方法采用 PCR-单链构象多态技术和 DNA 直接测序法检测110例脑梗死患者、10个脑梗死家系成员和100名健康对照者的 P47^(phox)基因第10外显子 C923T 多态性;酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),免疫比浊法测定 apoA-I 及 apoB100,酶联免疫吸附法测定脂蛋白a血清水平。结果 P47^(phox)基因第10外显子C923T 多态存在 CC、CT、TT 三种基因型,脑梗死组及其各亚组 C923T 多态基因频率分布与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);脑梗死组和对照组 CT 基因型血清 TG 水平均明显高于 CC 基因型(P<0.05)。结论 P47^(phox)基因 C923T 多态性可能与脑梗死的易患性无关,但与血脂代谢有一定相关。

玉夏胶囊对自发性高血压大鼠心肌损伤的保护作用

目的:观察玉夏胶囊对自发性高血压大鼠(SHR)心肌i NOS、NADPH氧化酶亚单位p22^(phox)和p47^(phox)表达的影响,探讨玉夏胶囊对SHR心肌损伤的保护作用机制。方法:14周龄雄性SHR 28只,随机分为SHR模型组[0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5 m L/kg]、玉夏胶囊高、中、低(0.6、0.3、0.15 g/kg)剂量组,每组7只。另设WKY(0.5%CMC-Na 5 m L/kg)正常对照组7只。各组每日灌胃1次,连续10周,于给药前和末次给药后尾袖法测定血压;比色法测定心肌组织SOD、MDA、T-AOC及H2O2的含量;硝酸还原酶法测定心肌组织NO含量;免疫组化法表达心肌诱导型一氧化氮合酶(i NOS)阳性细胞;Western Blot表达心肌组织i NOS、p22^(phox)及p47^(phox)蛋白。结果:玉夏胶囊随着剂量的增加,能显著降低SHR的血压(P<0.05或P<0.01),减少SHR心肌组织MDA、H2O2及NO的含量(P<0.05或P<0.01),提高SOD和T-AOC的含量(P<0.05或P<0.01),抑制心肌i NOS阳性细胞表达,下调心肌i NOS、p22^(phox)和p47^(phox)蛋白(P<0.05或P<0.01)。结论:玉夏胶囊具有抗SHR心肌氧化应激的作用,其机制可能与下调心肌i NOS及p22^(phox)、p47^(phox)所介导的氧化应激损伤有关。

红杉醇对2型糖尿病大鼠肝病NADPH氧化酶亚单位p22 phox和p47 phox表达的影响

探讨红杉醇对2型糖尿病大鼠肝病NADPH氧化酶亚单位p22 phox和p47 phox表达的影响。采用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病大鼠肝病模型,红杉醇(50、25及12.5 mg.kg 1.d 1)治疗6周。于末次给药后测定血糖、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢(H2O2)、NO和胰岛素(Ins)的含量;real-time PCR测定肝脏p22 phox和p47phox mRNA表达;Western blotting法测定p22 phox和p47 phox蛋白表达,HE染色观察肝脏病理变化。结果发现,红杉醇各剂量组能降低模型大鼠空腹血糖、ALT、AST、Ins和H2O2含量,恢复胰岛素敏感指数(ISI)及体重,升高肝组织T-AOC和NO含量;降低肝组织NADPH氧化酶亚单位p22 phox和p47 phox mRNA及蛋白表达,改善肝细胞病理改变(水肿、点状或灶状坏死及炎症细胞浸润)。上述结果表明,红杉醇可通过降低NADPH氧化酶表达进而改善2型糖尿病大鼠肝病的氧化应激损伤。

氯胺酮抑制人离体中性粒细胞释放超氧阴离子的机制

目的研究氯胺酮的异构体S(+)氯胺酮[S(+)-Ket]和R(-)氯胺酮[R(-)-Ket]对中性粒细胞释放超氧阴离子的影响及机制。方法细胞色素C还原法测定3种刺激剂介导的中性粒细胞超氧阴离子释放量。用荧光分光法检测中性粒细胞内钙的水平。用Western Blot法检测中性粒细胞蛋白质p47phox磷酸化水平。结果S(+)-Ket和R(-)-Ket可抑制N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)介导的中性粒细胞释放超氧阴离子(P<0.01)。S(+)-Ket可抑制佛波豆蔻醚乙酸盐(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)介导的中性粒细胞释放超氧阴离子和钙离子的增加,而R(-)-Ket可轻度增加PMA介导的中性粒细胞释放超氧阴离子和促进钙离子的增加。S(+)-Ket抑制PMA介导中性粒细胞蛋白质p47phox磷酸化,而R(-)-Ket增强上述作用;钙螯合剂EGTA可取消R(-)-Ket对PMA介导中性粒细胞蛋白质p47phox磷酸化的抑制作用。结论S(+)-Ket通过PKC-钙信息通道,抑制NADPH氧化酶p47phox,抑制超氧阴离子的产生。

髓源性抑制细胞在长期抗HBV治疗患者中促进HBsAg阴转的作用和机制探讨

目的研究髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞、P47^phox在抗病毒治疗后获得HBsAg清除及未获得HBsAg清除的2种人群外周血中的频率和表达情况,探讨MDSCs在肝炎慢性化及HBsAg清除中的作用及机制。方法筛选2007年7月—2008年7月慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者80例予以抗HBV药物[恩替卡韦(博路定)]治疗。采用流式细胞术检测治疗前CHB组中12例及14例健康对照者外周血MDSCs、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞占外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总数的比例(即MDSCs、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞频率)。追踪CHB组患者,排除治疗过程中死亡、失访等患者,72例患者成功随访8年。检测抗病毒治疗8年后8例HBsAg转阴[HBsAg(-)组]与64例未转阴[HBsAg(+)组]患者PBMCs中MDSCs、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞频率,用Western blot技术检测P47phox蛋白的表达。结果治疗前CHB患者PBMCs中MDSCs频率显著高于健康对照者(P<0.05),而PBMCs中CD4^+T细胞、CD8^+T细胞频率与健康对照者无显著差异(P均>0.05)。抗病毒治疗后CHB患者中HBsAg(-)组PBMCs中MDSCs频率低于HBsAg(+)组,CD4^+T细胞及CD8^+T细胞频率显著高于HBsAg(+)组(P均<0.05)。抗病毒治疗后HBsAg(+)组外周血中P47phox蛋白表达显著高于HBsAg(-)组(P<0.05)。结论CHB患者对T细胞耐受可能与MDSCs抑制T细胞应答有关。MDSCs可能通过活性氧途径发挥免疫抑制功能,减少HBsAg清除。