杆状病毒P49蛋白的Caspase切割位点的鉴定

海灰翅夜蛾核型多角体病毒(SINPV)的p49基因,可抑制病毒感染引起的昆虫细胞sf9的凋亡.用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达的P49蛋白可抑制Caspase的活性.通过氨基酸序列测定发现,P49蛋白的91～95位的氨基酸序列是91TVTDG95.P49蛋白在体外可被人及家蚕Caspase切割,切割后均产生约10和40 kD的2个片段.经定点诱变得到的P49蛋白94位氨基酸突变体不能被人及家蚕Caspase切割,同时也失去对Caspase的抑制功能.而91位突变体蛋白仍可被Caspase切割,并保留了对Caspase抑制的部分活性.P49蛋白不仅作用于下游的效应Caspase,也可作用于上游的启始Caspase,它是一个广谱的Caspase抑制剂.

旋毛虫病p49抗原相关抗体的ELISA检测

目的以纯化的融合蛋白 p49/GST为抗原建立ELISA检测方法。方法对一批试验血清进行间接ELISA检测。结果 19份人工感染鼠血清、5份人工感染猪血清、4份旋毛虫病猪血清、4份病人血清呈IgG抗体阳性 ,2 1份人工感染鼠血清呈IgM抗体阳性 ,而正常对照血清及 30 0份屠宰场待检猪血清均呈阴性反应 ,其结果与常规压片法结果相符。

血清旋毛虫p49抗原IgG抗体的斑点金免疫渗滤法检测

目的 建立一种快速诊断人体旋毛虫感染的新途径。方法 以基因工程表达的猪旋毛虫融合蛋白p49/GST为抗原,将其结合于硝酸纤维素膜上,以胶体金颗粒结合的羊抗人IgG作为标记抗体,建立斑点金免疫渗滤法(Dot-immunogoldfiltration assay,DIGFA),检测人血清抗旋毛虫p49抗原IgG抗体。共检测76份旋毛虫患者血清并与酶联免疫吸附试验(ELISA)作对比研究。结果 抗原抗体通过渗滤在膜上反应,10min肉眼即可观察到结果,在76份患者血清的检测中,阳性率为98.68％,显著高于ELISA法的检出阳性率86.84％,(X2=7.94,P<0.01)。交叉试验与重复试验结果显示DIGFA具有较好的特异性及稳定性。结论 以纯化的融合蛋白p49/GST为抗原建立的DIGFA可快速准确检测旋毛虫病人血清特异性旋毛虫IgG抗体,具有推广应用的价值。

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1(GenBank登录号:FR682468.1)公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a(+)载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在16℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1∶64000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。