微RNA-181a-5p介导Sirt1/PPARγ信号通路促进肾病综合征大鼠细胞凋亡的机制研究

目的旨在探究微RNA(miR)-181a-5p对肾病综合征大鼠细胞凋亡的调控机制。方法该研究起止年限为2021年1月至2022年12月。使用阿霉素(ADR)构建肾病综合征大鼠模型及体外肾病综合征损伤模型,转染miR-181a-5p inhibitor/NC至体外细胞模型。使用生化分析仪分析血清肌酐、血尿素氮、血清白蛋白和尿蛋白,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测肾组织及大鼠肾足细胞miR-181a-5p表达水平,通过TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测miR-181a-5p的下游靶基因,双萤光素酶报告实验来验证miR-181a-5p与沉默信息调节因子1(Sirt1)靶向结合关系。使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,通过蛋白质印迹法检测Sirt1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)蛋白水平。结果肾病综合征大鼠miR-181a-5p相对表达水平为3.50±0.30,敲低miR-181a-5p,使得Sirt1蛋白表达水平从0.36±0.02上调至0.87±0.06,PPARγ蛋白表达水平从0.26±0.02上调至0.78±0.05。结论miR-181a-5p通过抑制Sirt1/PPARγ信号通路活性促进肾足细胞凋亡。

p53正向凋亡调控因子在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡过程中的作用

目的:研究吉西他滨对人胰腺癌AsPC-1细胞体外生长的作用机制。方法:用脂质体转染法将含有p53正向凋亡调控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)反义核酸的真核表达载体pcDNA3.1-PUMAAS和空载体pcDNA3.1导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为1、5、10和15μmol/L的吉西他滨溶液中作用72h。RT-PCR和Western印迹法检测不同组细胞经吉西他滨作用72h后的PUMA表达水平,MTT检测细胞生长抑制情况,FCM、Hoechst 33258荧光染色和TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果:吉西他滨促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当细胞转染PUMA反义核酸抑制PUMA表达后,受吉西他滨作用的细胞中PUMA蛋白表达明显降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞增殖明显增加。结论:吉西他滨促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制细胞生长,其诱导细胞凋亡与上调PUMA表达有关。

miR-455-3p调控sirt1表达对大鼠椎间盘髓核细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨miR-455-3p调控沉默信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,sirt1)表达对大鼠椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)细胞增殖及凋亡的影响。方法采用Ⅱ型胶原酶从大鼠腰椎椎间盘中分离NP细胞,并用甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)免疫荧光染色对其鉴定。NP细胞分成Ctrl组、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)组、IL-1β+NC inhibitor组、IL-1β+miR-455-3p inhibitor组、IL-1β+miR-455-3p inhibitor+si-NC组、IL-1β+miR-455-3p inhibitor+si-sirt1组,除Ctrl组外的五组细胞均使用10 ng/mL的IL-1β诱导NP细胞退变模型。实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miR-455-3p及sirt1 mRNA水平;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测增殖;JC-1染色检测线粒体膜电位;Hoechst染色检测凋亡;蛋白免疫印迹检测sirt1、增殖(PCNA、Ki67、Cyclin D1)和凋亡(Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3)相关蛋白及CollagenⅡ、Aggrecan表达;双荧光素酶报告分析实验验证miR-455-3p与sirt1的靶向关系。结果大鼠椎间盘NP细胞被成功分离。与IL-1β组、IL-1β+NC inhibitor组比较,IL-1β+miR-455-3p inhibitor组miR-455-3p表达、凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3表达及Bax/Bcl-2比值下降,细胞活力、PCNA、Ki67、Cyclin D1、Bcl-2、CollagenⅡ、Aggrecan表达升高(P<0.05)。miR-455-3p直接靶向负调控sirt1表达。干扰sirt1可逆转抑制miR-455-3p表达对NP细胞增殖、凋亡的影响。结论抑制miR-455-3p表达可通过靶向调控sirt1,抑制IL-1β诱导的NP细胞凋亡并促进NP细胞增殖。

p53正向凋亡调控因子(PUMA)在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡过程中的作用

目的研究吉西他滨体外对人胰腺癌AsPC-1细胞生长的作用机制。方法用脂质体转染法将PUMA反义核酸(反义PUMA cDNA)的真核表达载体pcDNA3.1-PUMAAS和空载体pcDNA3.1-导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度1、5、10和15mol/L的吉西他滨中作用72h.。RT-PCR和Western blotting检测不同组细胞经吉西他滨作用72h后的PUMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Hoechst 33258荧光染色法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡。结果吉西他滨促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当细胞转染PUMA反义核酸抑制PUMA表达后,受吉西他滨作用的细胞出现PUMA蛋白表达明显降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖。结论吉西他滨促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制其生长,其诱导凋亡与上调PUMA有关。

微小RNA-221在宣威肺癌细胞中对靶基因p53正向凋亡调控因子调控机制的研究

目的探讨宣威肺癌细胞中微小RNA-221(miR-221)对靶基因p53正向凋亡调控因子(PUMA)的调控机制。方法在宣威肺癌细胞株(XWLC-05)中转染miR-221过表达/抑制表达载体后,将实验分为4组,Control组:未转染任何质粒;Scramble组:转染PUMA质粒;Over-miR-221+PUMA组:转染miR-221过表达载体、PUMA质粒;In-miR-221+PUMA组:转染miR-221抑制表达载体、PUMA质粒。应用实时荧光定量PCR技术检测各组PUMA在mRNA水平的表达差异。荧光素酶报告实验验证PUMA是否为miR221的靶基因。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析miR221对细胞增殖的影响。检测Caspase3/7、9活性分析miR221对细胞凋亡的影响。结果 miR-221可以直接作用于PUMA基因的3’UTR端(t=-8.662,12.761,P<0.001);过表达转染组能够有效地促进宣威细胞增殖,抑制表达转染组能够有效地抑制宣威细胞增殖(24 h:F=98.181,P<0.001;48 h:F=109.561,P<0.001;72 h F=143.782,P<0.001)。在抑制表达转染组中Caspase3/7、9的酶活性是升高的(t=12.851,15.491,P<0.001);而过表达转染组中Caspase 3/7、9酶活性与Control组及Scramble组差异无统计学意义(t=-2.181,P=0.061;t=-2.056,P=0.074);各组PUMA基因的表达差异无统计学意义(H=1.262,P=0.532)。结论 PUMA为miR-221的靶基因之一,miR-221可能通过负向调控靶基因PUMA参与宣威肺癌的发生、发展。

乙醛脱氢酶2通过缺氧诱导因子／热休克蛋白因子及P53途径抑制心肌细胞凋亡

目的研究乙醛脱氢酶2(ALDH2)发挥心脏保护作用的途径。方法实验分细胞水平部分和动物模型水平部分。细胞水平部分:原代培养心肌细胞,分为对照组、缺氧组、ALDH2*1 (野生型,具备ALDH2活性)预处理缺氧组和ALDH2*2(缺失型,ALDH2活性缺失)预处理缺氧组。动物模型水平部分:制备ALDH2心脏高表达小鼠模型(5只),以注射空质粒的腺病毒小鼠作为对照组(5只),结扎冠状动脉左前降支,1个月后得到心力衰竭模型。运用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测缺氧诱导因子(HIF1α)／热休克蛋白因子(HSF1)和P53的表达情况。结果活性氧自由基(ROS)的产生并不随ALDH2(不论是野生型还是缺失型)的转染而发生改变,而且Western印迹法亦显示ROS下游的ERK、JNK的磷酸化也未发生改变,说明ALDH2并未通过ROS途径影响心肌细胞凋亡。4-羟壬烯(4-HNE)的产生在转入ALDH2*1后明显减少,而转入ALDH2*2后明显增多,提示ALDH2对心肌细胞的保护作用与加快4-HNE的消除有关。转入ALDH2*1后,HIF1α／HSF1明显升高,P53明显降低,而转入ALDH2*2后HIF1α／HSFl明显下降,P53明显升高。动物模型中HIF1α／HSF1和P53的表达情况与细胞水平的实验结果高度一致。结论ALDH2发挥保护心肌细胞的作用并非通过ROS途径实现,ALDH2至少部分是通过HIF1α／HSFl的上调和P53的下调实现抑制心肌细胞凋亡的作用。

白血病抑制因子对K562细胞增殖、凋亡及p53蛋白表达的影响

目的探讨白血病抑制因子(LIF)体外对K562细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法取对数生长期K562细胞接种于96孔板中,随机分为对照组和观察1～3组,分别加入质量浓度为0、5、10、40μg/L的重组人LIF,继续培养61、2、24、48 h;应用MTT法、Hoechst染色法观察各组K562细胞增殖活性、凋亡率,采用免疫组化法检测观察3组和对照组p53蛋白表达情况。结果观察1～3组不同时间细胞增殖活性均显著低于对照组,且观察1组>观察2组>观察3组、6 h>12 h>24 h>48 h(P均<0.05);观察1～3组不同时间细胞凋亡率均显著高于对照组,且观察1组<观察2组<观察3组、6 h<12 h<24 h<48 h(P均<0.05);观察3组各时间点p53蛋白阳性表达率均明显高于对照组,且6 h<12 h<24 h<48 h(P均<0.05)。结论 LIF能以浓度—时间依赖性抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,机制可能为上调p53蛋白表达。

生长抑制因子1剪接变异体调控p53信号通路诱导肝癌细胞凋亡

目的探讨生长抑制因子(ING1)调控p53信号通路诱导肝癌细胞凋亡的途径。方法通过脂质体转染的方法在体外培养的肝癌细胞株HepG2中过表达ING1基因3种剪接变异体,采用流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡率和细胞周期变化,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测ING1、p53及其下游信号基因bcl-2、bax、p21waf1、mdm2、p14arfmRNA和蛋白表达情况,荧光素酶双标报道基因检测下游p21waf1启动子活性,Western blot检测野生型p53蛋白半衰期变化,使用免疫共沉淀法(IP)观察ING1剪接体与mdm2、p14arf蛋白间的结合情况。结果 HepG2细胞转染过表达ING1不同剪接变异体,pcDNA3-ING1b[(24.36±0.97)%]和pcDNA3-ING1c[(27.33±1.12)%]组细胞凋亡率显著高于空载体组[(8.22%±0.86)%](P<0.01),而pcDNA3-ING1a组细胞凋亡率[(8.90±1.03)%]与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空载体组比较,pcDNA3-ING1b和pcDNA3-ING1c组均出现G0/G1期阻滞(P<0.05);而pcDNA3-ING1a组各细胞周期的比例与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR及Western blot法结果显示过表达ING1b或ING1c使HepG2细胞内源性bax、p21waf1、p14arfmRNA及蛋白表达量明显增高(P<0.01);内源性bcl-2、mdm2 mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.01);过表达ING1a的HepG2细胞bax、bcl-2、p21waf1、mdm2、p14arfmRNA及蛋白表达与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05)。ING1b和ING1c增强p21waf1启动子活性,延长野生型p53蛋白的半衰期,促进p53蛋白乙酰化,并且与p53反馈调节环路基因mdm2和p14arf结合,维持p53蛋白的稳定性和促进p53蛋白的活性。结论 ING1剪接变异体通过与p53负反馈调节基因mdm2竞争性结合p53蛋白,延长野生型p53蛋白半衰期,并促进p53蛋白乙酰化,增强p53蛋白下游基因bax、p21waf1、p14arf表达,抑制bcl-2、mdm2基因表达,促进肝癌细胞凋亡。

外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响

目的研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法将40只大鼠随机分为4组:正常对照组、长期大量吸烟组、短期大量吸烟组、吸烟+bFGF组(吸烟最后15d经腹腔内注射bFGF)。采用线栓大脑中动脉法建立大鼠脑梗死模型。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL法)及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P<0.01),凋亡细胞数量和p53蛋白表强度随吸烟时间和剂量增加而增加(P<0.01)。bFGF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P<0.01)。结论吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加,p53介导吸烟诱导的细胞凋亡,细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关,bFGF通过抑制p53表达减少细胞凋亡。

外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响

目的研究外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法将40只大鼠随机平均分为正常对照组、长期大量吸烟组(燃烧香烟10支×2次/d,共90d)、短期大量吸烟组(燃烧香烟10支×2次/d,共45d)、吸烟+bFGF组(燃烧香烟10支×2次/d,共90d,吸烟最后15d经腹腔内注射bFGF 200μg/ml),每组10只。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL法)及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P<0.01),凋亡细胞数量和p53蛋白表达强度随吸烟时间和剂量增加而增加。bFGF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P<0.01)。结论吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加,细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关,bFGF通过抑制p53表达减少细胞凋亡。

骨肉瘤发生中p53蛋白表达对细胞凋亡的调节

目的 :研究骨肉瘤发生中 p5 3蛋白表达对细胞调亡的调节。方法 :利用原位脱氧核糖核酸末端转移酶 (Insituterminaldeoxynucleotidetransferase ;ISTdT)标记技术和SP免疫组织化学方法分别检测骨肉瘤和良性骨肿瘤组织中凋亡细胞和p5 3蛋白的表达。结果 :骨肉瘤中 p5 3蛋白的阳性率 (76 .9% ,5 0 / 6 5 )和阳性表达强度明显高于良性骨肿瘤组织 (2 1.1% ,4/ 19) (分别为P <0 .0 1和P <0 .0 5 ) ,但 4种亚型之间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。骨肉瘤组织中凋亡细胞密度均明显低于良性骨肿瘤组织 (P <0 .0 1) ,但各亚型之间两者亦均无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;骨肉瘤和良性骨肿瘤组织中p5 3蛋白表达与凋亡细胞密度呈明显的线性负相关 (r =- 0 .895 4,P <0 .0 1) ,其表达增强则凋亡细胞密度逐渐降低。结论 :在骨肉瘤发生中 p5 3基因突变可能是一种频发事件。突变型 p5 3基因可能是通过其蛋白过度表达抑制肿瘤细胞凋亡 。

细胞凋亡调控因子-2、p53基因、细胞增殖因子-67、细胞角蛋白-7在腺性膀胱炎与膀胱上皮癌组织中表达的研究

目的探讨细胞凋亡调控因子-2(bcl-2)、p53基因(p53)、细胞增殖因子-67(ki-67)、细胞角蛋白-7(ck-7)在腺性膀胱炎与膀胱上皮癌组织中表达的相关性。方法用免疫组化法检测46例腺性膀胱炎、21例膀胱上皮癌组织以及11例正常膀胱黏膜组织中bcl-2、p53、ki-67、ck-7的表达情况,并进行相关性分析。结果在膀胱上皮癌、腺性膀胱炎、正常膀胱黏膜组织中,bcl-2表达阳性率分别为4.76%、69.57%、90.91%;p53表达阴性率分别为9.52%、84.78%、81.82%;ki-67表达阴性率分别为23.81%、71.74%、72.73%;ck-7表达阴性率分别为9.52%、21.74%、9.09%。bcl-2在腺性膀胱炎中表达明显低于膀胱上皮癌组织,但明显高于正常膀胱黏膜;p53、Ki-67在腺性膀胱炎中表达明显高于正常膀胱黏膜,但明显低于膀胱上皮癌组织;ck-7在膀胱上皮癌、腺性膀胱炎与正常膀胱黏膜组织中表达差异不明显(P>0.05)。结论 bcl-2、p53、ki-67在腺性膀胱炎的生物转归中占有重要地位,对临床诊断与治疗具有指导意义。

一枝蒿总黄酮类调节人肝癌细胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表达

应用体外细胞培养及 RT- PCR(reverse transcription PCR)分析了新疆一枝蒿总黄酮类作用后肝癌细胞 (肝癌、ATCC QGY- 770 1 )中凋亡基因 p53、Fas及细胞增殖基因 bcl- 2的表达及它们之间的差异 .结果发现一枝蒿总黄酮可诱导肿瘤细胞分化 ,对肿瘤细胞的增殖及 DNA的合成有明显的抑制作用 ,并且指出其诱导细胞凋亡是从细胞周期的 G0 /G1期开始的 .用 5mg/L、1 0 mg/L的一枝蒿总黄酮处理肝癌细胞 2 4 h、36h及 72 h时有大量的野生型 p53基因表达而 Fas及 bcl- 2基因未见表达 .结果表明 ,一枝蒿总黄酮类诱导野生型 p53基因的表达可能是它间接清除体内恶变细胞及提高机体免疫功能的分子机制之一 .

丹参酮ⅡA联合5-FU对低氧下人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α和突变型P53表达的关系

目的:观察低氧环境下不同浓度的丹参酮ⅡA(TanⅡA)联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α和突变型P53的表达.方法:用氯化钴(CoCl2)创建低氧模型,采用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的TanⅡA联合10.0mg/L的5-FU分别作用于低氧SGC7901细胞24、48和72h,MTT法检测细胞活力;用上述同样方式作用于低氧SGC7901细胞24、48和72h后,Hoechst染色法检测细胞凋亡;TanⅡA(0、0.5、2.0、10.0mg/L)联合10.0mg/L的5-FU作用于低氧SGC7901细胞48h后,免疫细胞化学二步法检测HIF-1α及突变型P53的表达.结果:低氧环境下,不同浓度的TanⅡA联合10.0mg/L5-FU呈时间、剂量依赖性地抑制SGC7901细胞的增殖(均P<0.01),10.0mg/LTanⅡA联合5-FU作用细胞72h后,其抑制率为67.46%.0.5-10.0mg/LTanⅡA联合5-FU作用细胞24、48、72h,TanⅡA呈时间、剂量依赖性地促进SGC7901细胞凋亡(均P<0.01).HIF-1α及突变型P53表达明显高于常氧组(t=22.786,13.914,均P<0.01),不同浓度的TanⅡA联合10.0mg/L5-FU作用细胞48h后,HIF-1α、突变型P53蛋白表达明显降低(F=182.234,130.062,均P<0.01),且二者呈高度正相关(n=5,r=0.995,P<0.01).结论:在低氧环境下,TanⅡA可能通过抑制HIF-1α及突变型P53蛋白表达从而增强5-FU抑制SGC7901细胞增殖及诱导凋亡作用.

脑缺血耐受与细胞凋亡及p53、p21、Bax表达关系的实验研究

目的 探讨大鼠局灶性缺血预处理的脑保护作用与细胞凋亡及凋亡相关因子p5 3、p2 1和Bax的关系。方法 采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉造成脑缺血预处理和致死性缺血模型 ,图像分析测算相对梗死体积 ,使用TUNEL染色标记神经细胞凋亡 ,免疫组化染色观察p5 3、p2 1和Bax蛋白表达。结果 与致死缺血组比较 ,缺血预处理组梗死体积减少 4 6 % (P <0 0 5 ) ,半暗区TUNEL阳性细胞数和p5 3阳性细胞数均明显降低 (均P <0 0 5 ) ,p2 1和Bax阳性细胞数无显著变化 (均P >0 0 5 )。结论 缺血预处理可能通过抑制严重缺血后p5 3表达 ,减轻神经细胞凋亡 ,发挥脑保护作用。p2 1和Bax在脑缺血耐受形成中可能不起重要作用。

低氧时NF-κB和P53在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡中的变化

对培养的肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)用免疫细胞化学、Western blot和原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)进行检测。免疫细胞化学染色发现无血清培养基 (SFM)组中 PASMC核因子 - κB(NF- κB)阳性指数明显低于低氧 48h (H48h)组 (P<0 .0 5 ) ,H48h组 P5 3阳性指数与 SFM组相比有增高趋势。增殖细胞核抗原阳性指数(PI)在 SFM组明显低于 H48h组 (P<0 .0 5 ) ,SFM组抑制性 - κBα(I- κBα)的含量是 H48h组的 2 .5倍 ,SFM组的凋亡指数 (AI)明显高于 H48h组 (P<0 .0 5 ) ;NF- κB阳性指数与 AI呈负相关 (r=- 0 .737,P<0 .0 5 )而与 PI呈正相关 (r=0 .80 2 ,P<0 .0 5 )。提示 :低氧时 PASMC中 NF- κB活性明显增加 ,表明 NF- κB可能抑制 PASMC的凋亡并促进其增殖 ;低氧时 P5 3有增高的趋势 ,其对 PASMC增殖和凋亡的影响可能被激活的 NF- κB抑制。

涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的诱导与P53基因的修复

目的 探讨涎腺腺样囊性癌 (salivaryadenoidcysticcarcinoma) p5 3基因的突变以及重组人肿瘤坏死因子α(recombinedhumantumornecrosisfactor-α ,rhTNF -α)诱导凋亡过程中 p5 3基因的修复。 方法 ①在裸鼠移植瘤模型上 ,采用TNF -α 10 0× 10 4IU/kg或 10× 10 4IU/kg瘤体内注射 ,诱导腺样囊性癌移植瘤细胞凋亡 ;②采用DNA核酸序列测定方法 ,对移植瘤及凋亡诱导后的肿瘤分别进行 p5 3基因 6、7、8外显子的测定。 结果 发现腺样囊性癌移植瘤 p5 3基因第 8外显子的第 2 73、2 80号位点有点突变 ,其中 2 73位点为GCA→GCG ;2 80位点为GAG→GAC。第 6、7外显子未见突变。采用TNF -α治疗后 ,第 8外显子的第 2 80号突变位点得以修复正常 ,GAC→GAG ;而 2 73号突变位点未被修复。第 6、7外显子序列无变化。结论 ①涎腺腺样囊性癌发生中 p5 3基因的第2 73、2 80号密码子有点突变 ;②TNF -α可以修复p5 3基因突变中的C :G配对的点突变 ,不能修复A :G碱基的突变 ;③TNF -α对正常基因序列没有影响。

HIF-1α反义寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α、P53、Bcl-2表达及凋亡的影响

背景与目的：本实验研究缺氧诱导因子HIF-1α反义寡核苷酸（antisense oligonueleotides，ASODN）在缺氧环境下对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α、P53、Bel-2表达及细胞凋亡的影响，进一步探讨HIF-1α在缺氧诱导肿瘤细胞凋亡的过程中的作用机制。方法：设计针对HIF-1α RNA亚基的反义、正义寡核苷酸（sense oligodeoxynueleotides，SODN），并建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型，观察缺氧培养不同时相（8、16、24h）5μmol／L的HIF-1α反义寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α、P53、Bel-2表达及细胞凋亡的影响。半定量RT—PCR方法检测HIF-1α、P53和Bcl-2 mRNA的转录水平，免疫组化（SP法）和免疫印迹（Western Blot）检测HIF-1α、P53和Bcl-2蛋白表达情况。流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：HIF-1α转录水平（8～24h）单纯缺氧组（22．0％～22．6％）及SODN缺氧组（22．0％～22．8％）与常氧组（20．2％～20．9％）比较未见明显改变，而在ASODN缺氧组（16．8％～18．5％）显著降低（P〈0．01）。其蛋白表达单纯缺氧组（33．1％～88．9％）、SODN缺氧组（32．5％～88．7％）随缺氧时间延长明显升高；而P53、Bel-2 mRNA水平单纯缺氧组、SODN缺氧组较常氧组均显著增强（3．4～7．5倍不等）（P〈0．05）。其蛋白的表达这二组也较常氧组均显著增强（2～大于37倍不等）（P〈0．05）。然而在ASODN缺氧组P53、Bel-2 mRNA活性明显减弱（11．5％～13．9％）（P〈0．05），蛋白表达水平也显著降低（13．6％～35．4％）（P〈0．05）：细胞凋亡率其他三组未见明显变化，但ASODN缺氧组显著增加（P〈0．05）。结论：缺氧可以通过诱导野生型P53的突变使HIF-1α和Bcl-2的过表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡。而HIF-1α反义寡核苷酸抑制HIF-1α活性后，可以抑制野生型P53的突变，降低Bcl-2的表达，导致细胞凋亡的增加。

延胡索总生物碱对慢性脑缺血大鼠海马沉默信息调节因子1/肿瘤抑制基因P53蛋白信号通路的调控作用及其机制研究

目的研究延胡索总生物碱(TAC)对慢性脑缺血(CCH)大鼠海马CA1区沉默信息调节因子1(Sirt1)/肿瘤抑制基因P53蛋白(P53)信号通路相关蛋白表达的影响,并探讨其作用机制。方法将大鼠按照随机数字表法完全随机分为假手术组、模型组、TAC高剂量组(14 mg/kg)、TAC低剂量组(7 mg/kg),每组6只。运用改良版双侧颈总动脉永久性阻断(BCCAO)法建立CCH大鼠模型,假手术组仅对双侧颈总动脉做分离处理。造模完成1周后,每组分别灌胃给予对应药物或等体积等渗盐水,每日1次,治疗持续14 d。采用苏木素-伊红染色法观察大鼠海马区病理变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿三磷酸缺口末端标记测定(TUNEL)法检测其神经元凋亡情况;免疫印迹染色和免疫组织化学法分别测定Sirt1、P53、P53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(BAX)在大鼠海马区的表达情况并进行各组间比较。结果(1)4组凋亡细胞数量和凋亡率差异有统计学意义(F值分别为71.417、76.835,均P<0.01)。4组间Sirt1、P53、PUMA、BAX、Bcl-2蛋白阳性表达区域平均积分光密度值差异均有统计学意义(F值分别为1178.390、42.465、867.413、110.656和131.801,均P<0.01)。4组间Sirt1、P53、PUMA、BAX、Bcl-2蛋白相对表达水平差异均有统计学意义(F值分别为9.497、11.863、58.552、186.855和12.466,均P<0.01)。(2)模型组大鼠海马区脑组织神经元较假手术组排列紊乱,胞核固缩增多,胶质细胞和炎细胞明显增多。与假手术组比较,模型组大鼠海马CA1区神经元凋亡细胞数量及凋亡率明显上升[分别为(10.8±1.5)个比(2.0±0.9)个和(35.5±4.5)%比(6.2±2.6)%;均P<0.05];Sirt1、Bcl-2蛋白阳性表达区域平均积分光密度值明显降低(84.6±6.6比244.6±4.9,138.5±6.7比210.9±10.0;均P<0.05),P53、PUMA、BAX蛋白阳性表达区域平均积分光密度值明显升高(156.8±11.6比93.5±11.6,151.3±3.3比38.0±4.0,87.0±5.0比38.4±5.5;均P<0.05);Sirt1、Bcl-2蛋白相对表达水平明显降低(0.51±0.07比0.74±0.07,0.36±0.03比0.53±0.05;均P<0.05),P53、PUMA、BAX蛋白相对表达水平明显升高(0.37±0.06比0.21±0.02,0.62±0.06比0.23±0.02,1.08±0.06比0.45±0.03;均P<0.05)。(3)TAC高、低剂量组大鼠海马区组织结构较模型组相对紧密均匀,神经元排列整齐,细胞结构也相对清晰完整。与模型组比较,TAC高、低剂量组神经元凋亡细胞数量[高、低剂量组分别为(3.8±0.7)、(6.2±1.2)个]及凋亡率[高、低剂量组分别为(12.4±2.8)%、(20.2±3.9)%]均明显下降(均P<0.05);Sirt1、Bcl-2蛋白阳性表达区域平均积分光密度值(高、低剂量组Sirt1分别为150.0±4.8、131.3±1.3,Bcl-2分别为207.1±7.4、169.5±3.9)明显升高(均P<0.05),P53、PUMA、BAX蛋白阳性表达区域平均积分光密度值(高、低剂量组P53分别为105.9±8.8、115.5±9.0,PUMA分别为56.8±5.1、74.4±3.9,BAX分别为40.5±5.6、48.4±5.0)明显降低(均P<0.05);Bcl-2蛋白相对表达水平明显升高(高、低剂量组分别为0.53±0.05、0.47±0.02,P<0.05),P53、PUMA、BAX蛋白相对表达水平明显降低(高、低剂量组P53分别为0.21±0.02、0.24±0.04,PUMA分别为0.36±0.02、0.28±0.04,BAX分别为0.52±0.02、0.54±0.03;均P<0.05),TAC高剂量组Sirt1蛋白相对表达水平明显升高(0.71±0.05,P<0.05),TAC低剂量组Sirt1蛋白相对表达水平(0.52±0.08)差异无统计学意义(P>0.05)。结论TAC可以减轻CCH大鼠海马CA1区神经元损伤,降低海马区神经元细胞的凋亡率,其机制可能与TAC激活Sirt1/P53通路、抑制P53蛋白活性,从而调控其下游凋亡相关蛋白的表达水平有关。