P53结合位点对人NOD8基因的调控

目的:探讨P53结合位点在NOD8基因调控中的作用。方法:利用生物信息学方法,我们发现人与黑猩猩的NOD8基因核心启动子区域相似位置含有P53结合位点;以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因序列,构建含有/缺失人P53结合位点的NOD8基因启动子驱动的、表达绿色荧光蛋白-NOD8融合蛋白的质粒pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8;将构建的重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导瞬时转染HEK293细胞中,并加入不同浓度的P53抑制剂pifithrin alpha(PFT-α)处理HEK293细胞,用RT-PCR和Westren blotting方法检测NOD8 mRNA和蛋白的表达;此外,用pNOD8(760 bp)-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用染色质免疫共沉淀法(ChIP)观察P53是否与NOD8启动子结合。结果:经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功。ChIP实验证实P53能与NOD8启动子结合。pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组中NOD8 mRNA的表达显著高于pEGFP-C2转染组(P<0.05),并且NOD8 mRNA在缺失人P53结合位点的mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8转染组中的表达明显降低(P<0.01);同时发现加入PFT-α的pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8 mRNA的表达显著下降,并呈剂量依赖关系,其中90μmol/L PFT-α对NOD8mRNA表达的抑制作用最为显著(P<0.01)。与mRNA检测结果一致的是pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8蛋白的表达量显著高于对照组pEGFP-C2;而mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8蛋白的表达量明显低于pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组和加入PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组(P<0.01)。结论:P53结合位点在NOD8基因调控中起着重要的作用,并且P53结合位点与NOD8基因之间可能存在正反馈调节。

P53结合位点在NOD8启动子基因克隆调节及其对NOD8基因中的作用

为探讨P53结合位点在NOD8基因调控中的作用,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有P53结合位点人NOD8基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-C2中,构建含有人P53结合位点的人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8;并构建P53结合位点缺失突变载体pEGFP-C2-NOD8,将构建的质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。用不同浓度的p53抑制剂PFT-α(pifithrinalpha,PFT-α)预处理HEK293细胞24 h后,将重组质粒pEGFP-C2-NOD8wt瞬时转染HEK293细胞,观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明pEGFP-C2-NOD8wt和mpEGFP-C2-NOD8经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功。细胞转染后,缺失P53结合位点的NOD8启动子驱动的绿色荧光蛋白荧光强度明显低于含P53结合位点的重组质粒;且不同浓度PFT-α预处理HEK293细胞后重组质粒绿色荧光蛋白表达下降呈剂量依赖性。结论是P53结合位点突变重组质粒在HEK293细胞中其绿色荧光表达明显减弱;PFT-α可以通过抑制P53表达使重组质粒pEGFP-C2-NOD8wt在细胞中绿色荧光表达呈剂量依赖性减弱。说明P53结合位点在NOD8基因调控中发挥了正调节作用。

含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。

p53直接调控microRNA及其靶基因的高通量筛选

通过对676条人microRNA进行筛选,共得到了53条新的具有p53-DNA结合位点且调控p53上游转录因子和下游靶基因的microRNA.结合已有蛋白质互作关系与microRNA调控信息,构建了p53-microRNA相互作用网络图,其中FAS受多条microRNA调控,FAS是介导细胞凋亡的关键因子,因此,FAS-microRNA的相互作用可能在细胞凋亡途径中起着关键的作用.随后,提出了microRNA参与p53调控的假设机制,认为p53调控靶基因与microRNA的同时也受上游转录因子与microRNA的调控,从而形成了以p53为中心的一种平衡,当这种调控平衡一旦被打破则会引起信号通路的紊乱,从而可能引发相应的疾病.对这53条microRNA进行靶基因预测,共得到15500个靶基因,对这些基因的出现频率进行聚类分析共得到27个簇,将出现频率大于10的基因进行功能注释分析,发现多数基因功能属于近来发现的p53靶基因新的功能分类——细胞粘连和细胞运动,目前研究认为,p53通过与这些具有细胞粘连和运动功能的靶基因结合来抑制肿瘤的迁移.通过对15500个基因进行功能注释分析,得到了30条感兴趣的参与细胞周期调控、细胞凋亡和细胞增殖的microRNA,其中有9条microRNA于3种生物学进程均有参与,这9条microRNA分别是:hsa-mir-181a-1、hsa-mir-181b-1、hsa-mir-181c、hsa-mir-181d、hsa-mir-195、hsa-mir-497、hsa-mir-495、hsa-mir-543和hsa-mir-548c.这暗示着这9条microRNA在p53信号通路的调节中可能起着关键的作用,它们互相作用共同调节着多个p53信号环路.最后在36个物种的基因组中对这30条microRNA进行了同源性搜索与保守性分析,结果发现有10条高度保守的且为目前数据库所未收录的microRNA.这10条microRNA分别是:hsa-mir-497、hsa-mir-495、hsa-mir-543、hsa-mir-19a、hsa-mir-19b-1、hsa-mir-200b、hsa-mir-448、hsa-mir-28、hsa-mir-455和hsa-mir-590.

p53靶基因结合区遗传变异与中国人群乳腺癌遗传易感性的关联研究

目的 探讨p53靶基因结合区遗传变异与中国人群乳腺癌遗传易感性的关系。方法 通过公共数据库下载乳腺癌细胞系ChIP-seq数据和各种生物信息学方法，筛选可能影响p53靶基因结合区的遗传变异。采用大样本病例-对照研究揭示p53靶基因结合区遗传变异与乳腺癌遗传易感性的关系。结果 利用生物信息学分析方法共筛选出p53靶基因结合区的3个多态位点，并在1 274例乳腺癌病例和1 255名健康女性对照进行关联研究。病例组和对照组年龄差异无统计学意义（P=0.318），绝经状况、吸烟和饮酒在病例组和对照组的分布差异无统计学意义，其对应的P值分别为0.539、0.258和0.131。VMP1-rs1295925各基因型在病例组和对照组的分布差异有统计学意义。校正年龄、绝经状况以及吸烟饮酒等后，携带rs1295925-CT和TT基因型的个体与携带rs1295925-CC基因型的个体相比，其患乳腺癌的风险分别增加了32%（OR=1.32，95% CI：1.07～1.62）和41%（OR=1.41，95% CI：1.13～1.78）。在等位基因模型、显性模型以及相加模型中也均发现了该遗传变异显著增加乳腺癌发病风险。结论 位于VMP1基因上的rs1295925可能是乳腺癌的遗传易感位点，后续需要生物学功能实验对结果进行验证。