增殖细胞核抗原与p55PIK结合调控乳腺癌细胞MCF7增殖的研究

目的观察p55PIK对乳腺癌细胞MCF7细胞周期及增殖的影响,并探讨其可能的机制。方法通过转染质粒或特异性si RNA,在乳腺癌MCF7细胞中过表达或低表达p55PIK,继而通过免疫印迹法检测p55PIK的表达,通过Brd U/PI双掺入法测定细胞DNA合成及细胞周期,并用CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒检测细胞增殖,最后通过免疫共沉淀技术检测明确p55PIK是否可以与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相结合。结果 p55PIK过表达质粒及si RNA可分别使MCF7细胞中p55PIK成功过表达或低表达,而且过表达p55PIK可加快MCF7细胞的DNA合成,p55PIK组[DNA合成比率为(56.33±1.63)%]与Vector组[DNA合成比率为(26.27±1.85)%]比较差异有统计学意义(P<0.01),过表达p55PIK促进MCF7细胞从G0/G1期进入S期,从而调节其增殖,p55PIK组[OD450nm:(1.46±0.04)]与Vector组[OD450nm:(1.16±0.16)]比较差异有统计学意义(P<0.05),而低表达p55PIK可抑制上述过程。免疫共沉淀证实p55PIK与PCNA之间可以相结合。结论 p55PIK可促进乳腺癌细胞MCF7细胞周期进程及增殖,而且p55PIK可与PCNA相结合。

p53通过调控p55PIK抑制肝细胞癌SMMC-7721细胞的增殖

目的探讨p55PIK对肝癌SMMC-7721细胞增殖能力的影响,及p55PIK上游可能的调控机制。方法以肝癌SMMC-7721细胞为研究对象,通过脂质体转染p55PIK特异性小干扰RNA(siRNA)si-p55构建p55PIK低表达的实验模型。通过CCK8检测p55PIK对肝癌SMMC-7721细胞增殖能力的影响。通过流式细胞术检测p55PIK对细胞周期进程的影响。转染针对p53的小干扰RNA(siRNA)si-p53低表达p53,采用Western blot检测p53对p55PIK表达的影响,并通过CCK8法检测p53对p55PIK在肝癌细胞增殖调控中的作用。结果低表达p55PIK可导致肝癌SMMC-7721细胞的增殖能力降低[转染后96h,si-NC组、si-p55组的A值分别为(1.325±0.050)、(1.183±0.019)],细胞周期G0/G1期阻滞[si-NC组:(39.07±2.02)%;si-p55组:(49.66±1.05)%]。低表达p53可在肝癌SMMC-7721细胞中上调p55PIK的表达。p55PIK可部分拮抗p53对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。结论p53可部分通过调控p55PIK抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖。

Sirt1和P55PIK在胃癌中的表达及临床意义

目的研究Sirt1和P55PIK在胃癌组织中的表达水平及其与临床病理参数的关系,并初步探讨Sirt1和P55PIK在胃癌组织中表达相关性。方法采用免疫组织化学方法检测45例胃癌组织及癌旁正常组织中Sirt1和P55PIK表达水平,同时提取15例胃癌及癌旁正常组织蛋白行Western blot检测Sirt1和P55PIK表达水平。结果 Sirt1和P55PIK在胃癌组织中的表达阳性率分别为55.56%和64.44%,明显高于癌旁组织中的24.44%和35.56%(P<0.05)。Sirt1和P55PIK表达与患者性别、年龄、肿瘤直径及浸润深度无明显相关性,但与胃癌TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05)。Western blot检测显示15例患者Sirt1和P55PIK在胃癌组织中表达水平明显高于癌旁正常组织。Spearman相关性分析显示,Sirt1与P55PIK在胃癌组织中表达呈正相关(r=0.363,P=0.015)。结论 Sirt1和P55PIK表达与胃癌淋巴结转移和肿瘤分期密切相关,表明在胃癌的发病过程中可能有Sirt1和P55PIK的参与,联合检测可作为判断胃癌预后和筛选高危转移患者的指标,并可作为有效的治疗靶点。

高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响

目的构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携带p55PIK基因的pcDNA3.1质粒转染LoVo细胞,加入适量的G418筛选(500μg/mL),并通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测p55PIK mRNA水平和蛋白水平,进一步通过BrdU/PI掺入法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响。结果成功构建了p55PIK高表达的质粒,并筛选出稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系;在LoVo细胞中高表达p55PIK能够促进细胞S期的进程和DNA的合成。结论成功构建了pcDNA3.1-p55PIK质粒,并筛选出p55PIK稳定高表达的LoVo细胞系,高表达p55PIK能够促进LoVo细胞S期的进程和DNA的合成。

反义p55PIK慢病毒载体的构建及其对甲状腺癌细胞FTC236增殖的影响

目的:观察反义p55PIK慢病毒对甲状腺癌细胞FTC236的增殖是否有抑制作用。方法:构建含p55PIK反义RNA的慢病毒载体并包装成慢病毒,使之感染FTC236细胞,得到稳定的细胞系后用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达情况,用Real-time PCR检测p55PIK的mRNA的表达情况。同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)法及BrdU掺入法检测各组细胞的增殖情况。结果:构建的慢病毒感染甲状腺癌细胞FTC236的效率约为95%;Western blot证明反义p55PIK病毒可以使该细胞的p55PIK蛋白水平降低,mRNA水平降为对照组的(47±8)%(P<0.01)。MTT法检测发现反义p55PIK慢病毒感染后的FTC236细胞增殖明显受到抑制,增殖率为未处理组的(59±19)%(P<0.05)。且反义p55PIK慢病毒组的平均BrdU掺入率比未处理组降低了10.64%(P<0.02)。结论:反义p55PIK病毒可以通过抑制p55PIK蛋白的表达而抑制了FTC236细胞的增殖。

下调P55PIK基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖和迁移能力的影响

目的通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制P55PIK基因表达,观察下调P55PIK对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外增殖和迁移能力的影响。方法利用脂质体将特异性针对P55PIK的siRNA瞬时转染P55PIK高表达细胞株MDA-MB-231,以转染无关序列siRNA(siRNA-NC)和未转染细胞作为对照。通过Western blot检测其对P55PIK表达的下调效果,MTT法和Transwell实验分别检测MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力。结果 siRNA-P55PIK明显下调MDA-MB-231细胞中P55PIK蛋白的表达;MTT检测显示下调P55PIK后,MDA-MB-231生长明显受到抑制;Transwell实验显示siRNA-P55PIK组穿膜细胞数为(5.2±1.3),显著低于siRNA-NC组(18.6±3.8)和空白对照组(18.4±4.3)(P<0.05)。结论应用RNAi抑制P55PIK基因的表达可抑制MDA-MB-231细胞体外增殖和迁移能力,为乳腺癌的靶向治疗提供了新思路。

磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基p55PIK表达载体的构建及单克隆株的筛选

目的构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,在人胚胎肾细胞株HEK293中筛选其稳定表达的细胞株。方法 PCR扩增p55PIK基因全长,经过Xho1和Xma1酶切、T4DNA连接酶连接、DH5α转化,酶切和测序鉴定以确定构建质粒正确。转染人胚胎肾细胞株HEK293,G418筛选稳定表达p55PIK的单克隆细胞株,应用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达。结果 pEGFP-N1-p55PIK质粒经PCR、酶切、测序鉴定正确,经过G418筛选后获得稳定细胞株,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达,Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-p55PIK的细胞中p55PIK表达水平增高。结论正确构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,并在HEK293细胞中成功筛选出稳定表达p55PIK的细胞株,为进一步探讨p55PIK的功能提供了良好的工具。

PI3K p55PIK调节亚单位N末端抑制胃癌细胞株MGC803生长及其机制

背景与目的:p55PIK是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的调节亚单位之一。p55PIK依赖于其N末端独特的24个氨基酸结合Rb,这24个氨基酸的表达能抑制细胞周期的进程。本研究目的在于观察p55PIKN末端24个氨基酸的表达对胃癌细胞增殖和生长的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:通过Lipofectamine介导,用pEGFP-N24表达质粒转染MGC803细胞,用Westernblot鉴定融合蛋白GFP-N24在MGC803细胞中的瞬时表达;MTT法检测转染细胞的生长情况;克隆形成实验观察N24p55PIK过表达对细胞克隆形成能力的影响;动物实验观察表达N24p55PIK的细胞在裸鼠体内的成瘤能力;Westernblot法分析N24p55PIK表达对细胞周期蛋白CyclinD1表达的影响。结果:N24p55PIK在MGC803细胞中能够有效表达,但其表达量明显低于对照组。与对照组细胞相比,N24p55PIK的表达使细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长;表达N24p55PIK的细胞在克隆形成的数量上与对照组相比差异无显著性,但在克隆体积上明显小于对照组。表达N24p55PIK的MGC803细胞在裸鼠中的成瘤能力有所下降,其所形成肿瘤的重量和体积分别为(0.398±0.244)g和(408±268)mm3,而空载体对照组分别为(0.763±0.193)g和(829±271)mm3,两组相比差异有显著性(P<0.05)。N24p55PIK在MGC803细胞中的表达抑制CyclinD1的表达。结论:p55PIK调节亚单位N末端24个氨基酸的表达在体外和体内均能抑制肿瘤细胞的生长;减少CyclinD1的表达可能是其发挥作用的主要机制;来源于PI3K调节亚单位p55PIK的N24肽在肿瘤的治疗上可能具有潜在的应用前景。

p55PIK蛋白对ER(-/+)乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的观察p55PIK蛋白在雌激素受体(ER)阳性人乳腺癌细胞株MCF-7及ER阴性人乳腺癌细胞株MDAMB-231内的表达情况,并进一步探讨干扰p55PIK蛋白的表达对2种细胞增殖及迁移能力的影响,及可能的机制。方法Western blot检测p55PIK在MCF-7及MDA-MB-231细胞株内的表达情况;瞬时转染特异性针对p55PIK蛋白的siRNA,并以无关序列siRNA(siRNA-NC)和未转染细胞作为对照(blank),Western blot检测p55PIK蛋白表达的下调效果以及下调p55PIK后细胞内Akt及G蛋白偶联雌激素受体(G-protien coupled estrogen receptor,GPER)的表达变化;流式细胞术检测p55PIK表达下调对细胞周期的影响;MTT法和Transwell实验检测下调p55PIK后乳腺癌细胞增殖和迁移能力的改变。结果 p55PIK蛋白在人乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231内均有表达,在MDA-MB-231细胞内表达强于MCF-7细胞;siRNA-p55PIK明显下调MCF-7及MDA-MB-231细胞中p55PIK蛋白的表达;Transwell实验显示下调p55PIK后MCF-7及MDA-MB-231细胞迁移能力均下降,且MCF-7细胞的siRNA-p55PIK组迁移能力显著低于siRNA-NC组[(44.2±7.6)vs.(83.7±14.8)]以及空白对照组[(44.2±7.6)vs.(95.9±17.3)](均P<0.01),MDA-MB-231细胞亦是siRNA-p55PIK组显著低于siRNA-NC组[(94.6±9.7)vs.(179.5±19.1)]和空白对照组[(94.6±9.7)vs.(194.7±34.9)](均P<0.01);MTT检测显示下调p55PIK后,MCF-7及MDA-MB-231细胞生长均明显受到抑制;Western blot结果显示下调p55PIK蛋白后,Akt蛋白磷酸化水平变化不明显;ER(-)细胞MDA-MB-231内GPER蛋白表达增加,而ER(+)细胞MCF-7内GPER表达变化不明显。结论 p55PIK蛋白在人乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231内的表达有差异,下调p55PIK的表达可显著抑制MCF-7及MDA-MB-231细胞体外增殖和迁移能力,并可上调ER(-)细胞MDA-MB-231内GPER蛋白的表达,为ER(-/+)乳腺癌的预后观察及临床治疗提供了新思路。

p55PIK上调血管内皮生长因子促进结肠癌细胞血管的生成的作用

目的 观察p55PIK对结肠癌细胞（HT29）的血管内皮生长因子（VEGF）分泌及其对成瘤的影响,探讨肿瘤中p55PIK与血管生成之间的关系.方法 以携带有p55PIK基因的腺病毒感染肿瘤细胞,用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测空白组以及感染空腺病毒和p55PIK腺病毒的肿瘤细胞中VEGF mRNA水平表达差异;用Western blot的方法检测肿瘤细胞VEGF蛋白水平的表达差异;并以感染空腺病毒和感染p55PIK腺病毒的HT29细胞种植裸鼠,观察p55PIK对成瘤性的影响;以移植瘤行免疫组织化学染色,比较p55PIK、VEGF和CD31在组织中表达水平的差异.结果 细胞内过表达p55PIK后,VEGF mRNA表达水平较对照组和空腺病毒组增高2.7倍（P＜0.01）,蛋白表达水平也明显增高（P＜0.01）;成瘤性明显增强,移植瘤的生长速度增快,3组肿瘤重量分别为（0.057 ±0.040）、（0.060±0.030）、（0.225 ±0.070） g（P ＜0.01）.过表达p55PIK组的肿瘤组织中VEGF和CD31的表达水平明显增高.结论 过表达p55PIK的肿瘤细胞成瘤性的增强可能是通过提高VEGF的表达,从而促进肿瘤血管的生成来实现的.

抗肿瘤多肽TAT-N15p55PIK表达和纯化方法的改进及其应用

[目的]改进原核蛋白纯化方案,纯化抗肿瘤多肽TAT-N15p55PIK。[方法]通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和灰度扫描,筛选纯化蛋白最适合的菌株、确定目的蛋白浓度和纯度的准确检测方法,以及最佳诱导浓度。以咪唑洗脱,PBS透析和去除内毒素等方法,研究融合蛋白最佳纯化方案。以细胞免疫荧光和5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法检测经纯化的融合蛋白对间质肿瘤细胞增殖的影响。[结果]筛选出最适蛋白表达菌株;确定1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为最佳的蛋白诱导表达浓度;以BCA法和SDS-PAGE灰度扫描相结合的方法测定纯化蛋白的浓度及纯度;通过改进后的纯化步骤,融合蛋白纯度从36%提高为61%,浓度从0.72μg/μl提高为1.5μg/μl,可100%转导入Hela细胞,转导入T淋巴细胞白血病细胞Jurkat48h能够显著抑制细胞增殖,抑制率为20.31%(P<0.01)。[结论]经纯化的TAT-N15p55PIK具有一定的抑制间质肿瘤细胞增殖的能力,为融合蛋白TAT-N15p55PIK的抗肿瘤临床应用奠定了重要的工作基础。

p55PIK和血管内皮生长因子在乳腺癌患者中的表达及意义

目的探讨乳腺癌患者磷脂酰肌醇-3-激酶亚基p55γ(p55γofphosphatidylinositol3-kinase,p55PIK)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)水平变化及临床意义。方法73例乳腺癌患者为乳腺癌组,59例乳腺癌前病变患者为癌前病变组,52例乳腺增生患者为乳腺增生组。采用免疫组织化学法检测3组患者手术切除组织p55PIK、VEGF蛋白阳性表达率并比较分析。对乳腺癌组患者随访30个月,采用Kaplan-Meier生存曲线分析p55PIK、VEGF阳性表达与乳腺癌患者预后的关系,采用log-rank法比较生存差异。结果乳腺癌组p55PIK和VEGF阳性表达率(57.53%、71.23%)明显高于癌前病变组(35.59%、50.85%)和乳腺增生组(15.38%、26.92%)(P<0.05),癌前病变组高于乳腺增生组(P<0.05);乳腺癌组p55PIK阳性患者病死率(38.10%)高于p55PIK阴性患者(12.90%)(P<0.05),VEGF阳性患者病死率(34.62%)高于VEGF阴性患者(9.52%)(P<0.05)。结论p55PIK、VEGF阳性表达与乳腺癌的发生、发展有关,有可能成为乳腺癌临床治疗和预后的新靶点。

反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响

目的 观察反式转录激活因子-氨基端24个氨基酸（TAT-N24）穿膜融合多肽对结直肠癌血管形成的影响.方法 对结直肠癌细胞Lovo过表达p55PIK和/或同时给予p55PIK的特异性抑制剂TAT-N24后,通过Western blot法检测乏氧诱导因子-1α的表达,通过双荧光素酶报告系统检测血管内皮生长因子-A的启动子活性,并用酶联免疫吸附试验检测其蛋白分泌,最后通过体外血管形成实验检测p55PIK及TAT-N24对结直肠癌血管形成的影响.结果 过表达p55PIK促进结直肠癌细胞株Lovo中乏氧诱导因子-1α的表达,进而增强血管内皮生长因子-A的启动子活性（p55PIK组比对照组,常氧：9.1±1.1比1.0±0.2,乏氧：14.5 ±1.6比1.0±0.3）,并且促进其在培养基上清中的分泌[p55PIK组比对照组,常氧：（412±23） mg/L比（150±18） mg/L,乏氧：（859±203） mg/L比（233±12） mg/L],而且其条件培养基可促进脐静脉内皮细胞形成血管,而TAT-N24可拮抗上述过程,抑制结直肠癌的血管形成.结论 p55PIK可促进结直肠癌的血管形成,而TAT-N24作为其特异性抑制剂,可抑制结直肠癌的血管形成.