杨树脯氨酸合成关键基因PagP5CS1全长克隆及功能验证

杨树是重要的工业用材树种。我国北方干旱和半干旱地区水分匮乏,干旱已成为影响杨树人工林可持续发展的一个重要因素。游离脯氨酸的积累常常在植物应对干旱等渗透胁迫时出现,以缓解干旱胁迫带给植物的损害。P5CS作为编码脯氨酸合成关键酶的基因,对于植物调控游离脯氨酸合成、增强耐干旱能力非常关键。该研究克隆84K杨脯氨酸合成代谢的关键基因PagP5CS1并在银中杨内进行遗传转化,从表型、分子和生理水平上对PagP5CS1转基因杨树株系进行了功能鉴定。本研究构建的PagP5CS1超表达载体通过叶盘法转化至银中杨叶片,成功获得12个PagP5CS1超表达杨树株系,其中P5CS1基因表达量最高的转基因株系为野生型表达量的8.3倍。经过干旱胁迫处理,相对于野生型,超表达株系叶片萎蔫程度更低;在干旱胁迫下,超表达株系中P5CS1基因表达量和脯氨酸含量均高于野生型,说明P5CS1超表达增强了杨树的耐旱性,P5CS1基因在干旱胁迫下发挥了正向调控作用。综上所述,杨树P5CS1基因对干旱胁迫高度响应,PagP5CS1超表达杨树会通过增加脯氨酸积累来增强杨树的耐旱性。

转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性

为提高羽衣甘蓝的抗寒性,本试验将拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,检测转基因株系在4℃低温胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、叶绿素荧光参数(Fv/Fm)和植株存活率。结果显示,在4℃低温胁迫下,转基因植株的P5CS1基因的mRNA过量表达,脯氨酸含量、可溶性糖含量、Fv/Fm和植株存活率均显著高于野生型对照(P<0.05),但丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型对照(P<0.05)。表明拟南芥P5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的抗寒性。

木薯MeP5CS1基因的克隆、表达分析及载体构建

对从木薯Ku50叶片中克隆的1个P5CS基因Me P5CS1进行聚乙二醇(PEG)、脱落酸(ABA)、盐胁迫下的表达分析,结果表明,基因Me P5CS1具有1个2 220 bp的开放阅读框,编码739个氨基酸,且含有P5CS保守结构域;Me P5CS1与杨树、杞柳的P5CS基因亲缘关系相对较近,序列相似性分别达到88.61%、88.95%;Me P5CS1基因在第1张完全展开叶、老叶中的表达量受到PEG处理诱导,且与叶片中脯氨酸的含量变化趋势一致;Me P5CS1基因的表达还受到脱落酸(ABA)、盐胁迫处理的诱导。在此基础上,成功构建Me P5CS1基因的植物表达载体p CAMBIA 2300-Me P5CS1,为进一步解析Me P5CS1在木薯抗旱中的作用机制提供参考。

拟南芥脯氨酸合成关键酶P5CS1的功能鉴定及原核表达

在拟南芥中超表达P5CS1基因同时,对P5CS1蛋白原核表达条件进行摸索。结果表明:P5CS1超表达植株在正常生长和盐胁迫条件下脯氨酸积累均得到了显著增强,在培养基培养和土培条件下耐盐性均显著高于对照。原核表达结果显示,P5CS1蛋白在温度28℃、0.8mmol·L^(-1) IPTG条件下有高水平的诱导,且存在于大肠埃希菌的包涵体中。这一研究证实了P5CS1在脯氨酸积累中的作用及对渗透胁迫条件下植物的保护作用,其表达1个分子量约为76ku的融合蛋白。

藜麦内参基因筛选及盐胁迫相关基因表达分析

为了利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)分析藜麦(Chenopodium quinoa Willd)相关基因表达,提高结果的准确性,筛选出稳定表达的内参基因至关重要.我们分别利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper程序分析了6个藜麦候选内参基因在NaCl胁迫下表达的稳定性,并用实时荧光定量PCR技术对藜麦盐胁迫相关基因P5CS1和CMO基因相对表达量进行分析.结果表明,藜麦在NaCl胁迫下ACT-1和TUB-6做为内参基因表达最稳定,为最佳内参基因;藜麦P5CS1基因表达水平上调6倍左右,CMO基因上调30~40倍.本研究为NaCl胁迫下藜麦基因表达分析提供了可靠的内参基因,并且对NaCl胁迫下P5CS1和CMO基因表达情况做出初步分析.