抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组P6蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合技术制备杂交瘤细胞株;间接ELISA筛选阳性细胞克隆并检测染色体数目;测定细胞培养上清的mAb效价及特异性,鉴定mAb的免疫球蛋白类、亚类及抗原结合表位。结果获得2株抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的杂交瘤细胞株α2G3和γ2C4,染色体众数分别为103与95;间接ELISA结果证明细胞培养上清最高效价分别为1∶256和1∶512,未出现与其他种类细菌的交叉反应;α2G3为IgG2b、γ2C4为IgM,均为κ型;两者可能识别P6蛋白不同表位。结论成功制备了抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的mAb。

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的保护性研究

目的:探讨不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outer membrane proteinP6,P6)真核质粒的免疫保护性及其可能的保护机制。方法:构建pcDNA3.1/HisA-P6核酸疫苗,转染HeLa细胞;将P6质粒免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ和IL-4产生水平;CCK-8法分析脾淋巴细胞增殖情况,并建立小鼠NTHi感染模型,检测小鼠鼻咽部灌洗液NTHi数目变化;HE染色法分析鼻黏膜病理变化。结果:pcDNA3.1/HisA-P6在HeLa细胞中有目的蛋白的表达,免疫后pcDNA3.1/HisA-P6组小鼠脾淋巴细胞产生的IFN-γ及刺激指数均高于pcDNA3.1/HisA、PBS对照组(P<0.05),而IL-4的表达无差异;P6组鼻咽部NTHi清除率也显著高于对照组(P<0.01);病理显示P6组小鼠鼻黏膜组织结构基本正常,而对照组鼻黏膜紊乱、脱落。讨论:P6核酸疫苗可诱导小鼠产生明显的抗NTHi保护效应,其可能的保护机制包括细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫。

IL-2联合不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白对小鼠免疫功能的影响

目的观察IL-2联合不可分型流感嗜血杆菌重组P6蛋白免疫小鼠的免疫效果,探讨IL-2的佐剂效应。方法将50只Balb/c小鼠随机分为5组:P6重组蛋白组、P6重组蛋白+IL-2组、IL-2组、P6重组蛋白+弗氏佐剂组及PBS对照组,分别于第0、14、28天经腹腔进行3次免疫,末次免疫后14 d,取小鼠血、脾标本,ELISA法检测血清中抗体IgG水平,并分析其脾淋巴细胞IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ的产生水平。CCK-8法检测各组脾淋巴细胞增殖活性。结果 P6重组蛋白联合IL-2组通过腹腔免疫刺激小鼠产生的血清IgG水平,高于PBS对照组、P6重组蛋白组及IL-2组(P<0.05)。P6重组蛋白联合IL-2组小鼠特异性脾淋巴细胞刺激指数及其所产生的IFN-γ、IL-2水平均高于PBS对照组、P6重组蛋白组及IL-2组(P<0.05),而IL-4、IL-10水平各组无差异。各项检测中P6重组蛋白联合IL-2组与P6重组蛋白联合弗氏佐剂组无显著性差异(P>0.05)。结论 IL-2联合P6重组蛋白诱导小鼠的免疫应答优于P6重组蛋白单独免疫,IL-2可以作为不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白的佐剂。

不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白的原核表达及其黏膜免疫效应

目的:研究不可分型流感嗜血杆菌重组P6蛋白的免疫原性,以确定重组P6蛋白在不可分型流感嗜血杆菌疫苗研制中的应用价值。方法:扩增P6目的基因,构建重组质粒PGEX-6P2/P6,鉴定后将其转化入E.coli XL1-Blue,IPTG诱导、纯化后经SDS-PAGE、Western blot分析;纯化的重组蛋白经滴鼻方式免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清IgG,肺灌洗液IgA的水平及脾细胞中IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的产生水平。CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果:成功构建了重组表达载体PGEX-6P2/P6,并表达GST-P6融合蛋白。Western blot证明GST-P6蛋白能与菌源P6蛋白免疫小鼠后的抗血清发生特异性反应。动物实验表明重组P6蛋白通过滴鼻途径既能刺激小鼠产生血清IgG,又能诱导肺黏膜产生较高的特异性IgA抗体。重组蛋白+IL-2组小鼠脾淋巴细胞所产生的IL-17和IFN-γ的含量高于对照组(P<0.05)。结论:P6蛋白的原核表达载体PGEX-6P2/P6在大肠杆菌XL1-Blue中大量表达,重组P6蛋白经黏膜免疫可以同时诱导产生体液免疫和细胞免疫。此实验为P6蛋白疫苗的研发提供了理论基础。

不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势T-B联合抗原表位及其免疫原性研究

目的了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性。方法采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序。采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位。采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PIII蛋白(rPIII)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性。结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3%~100%和99.3%~100%。OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位。Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9%(59/62)、69.4%(43/62)和74.2%(46/62)NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性。结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位。

不同年龄人群血清不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白 P6及其 T-B 联合表位肽抗体水平

目的：研究不同年龄人群血清不定型流感嗜血杆菌（ nontypeable Haemophilus influen-za， NTHi）外膜蛋白P6及其T-B联合表位肽抗体水平，为NTHi 外膜蛋白P6多抗原肽疫苗的研究提供科学依据。方法构建NTHi P6原核表达系统，纯化重组蛋白P6，同时采用Epitope prediction 1．0软件和ANTIGENIC程序预测NTHi P6的T表位和B表位，合成T-B联合表位肽。以P6及其T-B联合表位肽为抗原，采用ELISA法检测血清中相应抗体水平。研究对象为605例来我院体检者，年龄范围为1天～103岁，组间抗体水平比较采用Mann-Whitney U检验，相关性采用Pearson相关分析法。结果研究中预测到NTHi P6的T-B联合表位肽有4条，分别是P6-2、P6-61、P6-95和P6-122。＜1个月组血清NTHi P6及其上述表位肽抗体水平均显著低于1～6个月组（ P均＜0．001）和7个月～3岁组（P均＜0．001）。7个月～3岁组 P6及其各表位肽抗体水平最高，显著高于4～6岁组（P 均＜0．01），4～6岁组又显著高于7～14岁组（P均＜0．01），其他各相邻年龄组间5种抗体差异较小。血清表位肽P6-2、P6-61、P6-95和P6-122抗体水平与P6抗体水平均显著相关（ P＜0．0001）。结论本研究预测的NTHi P6的T-B联合表位肽与P6在人血清中的抗体分布高度一致，提示其具有良好的免疫原性；7个月～3岁组儿童血清中P6及其表位肽抗体水平最高，可能与该年龄段NTHi感染率高有关。

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的生物信息学分析

目的克隆不可分型流感嗜血杆菌ATCC49247外膜蛋白P6基因,并对其编码蛋白进行分析。方法以标准菌株ATCC49247NTHI DNA为模板,PCR扩增P6目的基因,构建重组质粒pGEX-6P2/P6并测序,利用生物信息软件和GenBank数据库对编码外膜蛋白P6进行同源性分析,预测其主要理化性质、结构功能、B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。结果 ATCC49247 P6基因核苷酸序列长度为462 bp,与不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因核苷酸同源性为99.17%～100%,编码蛋白氨基酸同源性为96.18%～100%。编码蛋白含有153个氨基酸,相对分子质量为16.137 94×10~3,等电点6.09,为亲水性蛋白;该蛋白含有信号肽和3个结构域,无跨膜结构域;综合蛋白质的二级结构、亲疏水性、柔性、表面可及性和抗原指数预测该蛋白含有6个优势B细胞抗原表位,有7个CTL细胞抗原表位及16个Th细胞抗原表位。结论成功克隆外膜蛋白P6基因,生物信息学方法预测分析ATCC49247外膜蛋白P6高度保守,免疫原性强,可作为流感嗜血杆菌候选疫苗和疫苗载体。

不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的表达纯化及其在儿童血清中的抗体水平检测

目的建立不定型流感嗜血杆菌（NTHi）外膜蛋白P6原核表达系统并表达纯化P6,探索其在不同年龄儿童血清中的抗体水平。方法采用PCR扩增NTHi ATCC49247的P6基因pal,构建NTHi P6原核表达系统,采用亲和层析法纯化NTHi P6。血清P6抗体检测采用ELISA法,检测对象为2013年10-12月到杭州师范大学附属医院体检的儿童228例。组间抗体水平比较采用非参数检验。结果本研究所构建的原核表达系统能有效表达重组P6蛋白,该重组蛋白有可溶性形式存在,但包涵体较多。ELISA结果显示,〈1岁组P6抗体水平较低,中位数为9 904ELISA单位,1-3岁组则最高,中位数12 731ELISA单位,两者差异有统计学意义（Z=2.111,P=0.035）;1-3岁组血清P6抗体水平显著高于4-6岁组（中位数10 237ELISA单位,Z=2.015,P=0.044）,后者又显著高于7-14岁组（中位数7 207ELISA单位,Z=3.546,P〈0.01）。结论本研究构建的原核表达系统能表达可溶性重组P6,1-3岁儿童血清中P6抗体水平最高,可能与该年龄段NTHi感染率高有一定关系。

96例获得性肺炎患儿血清流感嗜血杆菌外膜蛋白P6及其表位肽抗体水平研究

目的 比较获得性肺炎(CAP)患儿血清流感嗜血杆菌外膜蛋白P6及其表位肽抗体水平,为CAP患儿疫苗研制提供依据.方法 选取某院2017年1月1日-2019年3月1日收治的96例CAP患儿,所有患儿均进行血清流感嗜血杆菌外膜蛋白P6及其表位肽抗体水平检测.比较1岁~3岁、4岁~8岁与9岁~12岁CAP患儿的血清不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6及其表位肽抗体水平.结果 1岁~3岁CAP患儿血清不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6及其表位肽P6-(2~25)、P6-(61~86)、P6-(95~120)、P6-(122~143)均显著高于4岁~8岁及9岁~12岁患儿.4岁~8岁患儿的血清P6及其表位肽抗体水平显著高于9岁~12岁患儿.结论 CAP患儿的血清不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6及其表位肽抗体水平与年龄有关,年龄越小,P6及其表位肽抗体水平越高,提示可能是年龄越小儿童血清流感嗜血杆菌发生率越高的原因.

MDC对不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白免疫原性的影响

观察巨噬细胞源趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)联合不可分型流感嗜血杆菌重组P6蛋白免疫小鼠的免疫效果,探讨MDC的佐剂效应。将50只BALB/c小鼠随机分为5组:P6重组蛋白+MDC,P6重组蛋白,MDC组,P6重组蛋白+IL-2组及PBS对照组,分别于第0 d、14 d、28 d经腹腔免疫3次,末次免疫后14 d,取小鼠血、脾标本,ELISA法检测血清中抗体IgG水平,并分析其脾淋巴细胞IL-10和IFN-γ的产生水平。CCK-8法检测各组脾淋巴细胞增殖活性。结果是小鼠血清IgG水平,P6重组蛋白联合MDC组高于PBS对照组、MDC组、P6重组蛋白+IL-2组及P6重组蛋白组(P<0.05)。P6重组蛋白联合MDC组小鼠特异性脾淋巴细胞刺激指数及其所产生的IL-10、IFN-γ水平均高于PBS对照组、MDC组及P6重组蛋白组(P<0.05)。因此MDC联合P6重组蛋白诱导小鼠的免疫应答优于P6重组蛋白单独免疫,MDC可以作为不可分型流感嗜血杆菌P6重组蛋白的佐剂。