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南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达
1
作者
胡昱颛
王全兴
+3 位作者
张金艺
宋水林
蒋军喜
熊桂红
《生物灾害科学》
2023年第4期432-437,共6页
【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核...
【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。
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关键词
南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)
RT
-
p
CR
p
7
-
2基因
原核表达
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职称材料
四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析
被引量:
1
2
作者
张上林
孙丽英
陈剑平
《浙江农业学报》
CSCD
北大核心
2013年第6期1298-1303,共6页
水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA,dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P...
水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA,dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6个非结构蛋白分别为P5,P6,P7-1,P7-2,P9-1,P9-2。在非结构蛋白中,P5,P6和P9-1已被证实参与形成毒质结构,P7-1被认为可在细胞质中形成类似管状的结构作为病毒胞间扩散的通道,P7-2和P9-2的功能目前尚不明确。文章采用Pull-Down和液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)等技术来鉴定水稻蛋白(日本晴)与P7-2蛋白间可能存在的互作关系。通过Pull-Down实验分析,发现有4种水稻蛋白可与P7-2相结合,其中2个蛋白为转录相关蛋白,1个为氨基转移酶,还有1个为假定的分子伴侣60前体。实时荧光定量PCR分析显示,感病寄主中的转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体的表达量上调,而氨基转移酶的表达量降低。
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关键词
水稻黑条矮缩病毒
p
7
-
2基因
原核表达
蛋白质互作
实时荧光定量
p
CR
下载PDF
职称材料
RBSDV P7-2基因重组AcMNPV的构建及其对sf9细胞的致死作用
3
作者
刘龙
孙丽英
王敦
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第1期81-87,共7页
[目的]为克服杆状病毒杀虫速度慢等固有缺点,首次尝试将异源病毒细胞凋亡诱导基因重组到昆虫杆状病毒中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。[方法]将带有SV40终止子的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica...
[目的]为克服杆状病毒杀虫速度慢等固有缺点,首次尝试将异源病毒细胞凋亡诱导基因重组到昆虫杆状病毒中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。[方法]将带有SV40终止子的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)的P7-2基因依次插入到供体质粒p Fast Bac-HTB的多克隆位点。使用供体质粒p Fast Bac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2基因的表达。通过转座的方法将ph、P7-2基因及启动子插入到bacmid b MON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测P7-2基因的表达。转染sf9细胞后通过光学显微镜观察重组病毒多角体的形成并统计不同时间细胞死亡数量。通过TCID50的方法绘制病毒生长曲线。[结果]成功构建了P7-2基因重组AcMNPV bacmid Ac-P7-2,Western blot检测到P7-2蛋白可以正确表达。在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,重组病毒v Ac-P7-2细胞死亡数量显著高于野生型病毒v Ac-WT,并发现重组病毒v Ac-P7-2多角体形成并释放的速度也快于野生型病毒v Ac-WT。病毒的生长曲线显示,在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,v Ac-P7-2的增殖速度显著快于v Ac-WT。[结论]成功构建了多角体形成迅速的重组病毒v Ac-P7-2,与野生型病毒v Ac-WT相比其具有较快的增殖速度,对寄主细胞有较强致死作用。
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关键词
RBSDV
p
7
-
2基因
重组AcMN
p
V
多角体形成速度
致死作用
下载PDF
职称材料
题名
南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达
1
作者
胡昱颛
王全兴
张金艺
宋水林
蒋军喜
熊桂红
机构
江西农业大学农学院
江西农业大学江西省薯芋生物学重点实验室
出处
《生物灾害科学》
2023年第4期432-437,共6页
基金
国家自然科学基金项目(31960533)
江西省自然科学基金项目(20192BAB214004)
江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ170293)。
文摘
【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。
关键词
南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)
RT
-
p
CR
p
7
-
2基因
原核表达
Keywords
SRBSDV
RT
-
p
CR
p7-2 gene
p
rokaryotic ex
p
ression
分类号
S432.1 [农业科学—植物病理学]
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职称材料
题名
四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析
被引量:
1
2
作者
张上林
孙丽英
陈剑平
机构
安徽农业大学植物保护学院
浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所/浙江省植物有害生物防控国家重点实验室培育基地/农业部植物保护与生物技术重点开放实验室/浙江省植物病毒重点开放实验室
出处
《浙江农业学报》
CSCD
北大核心
2013年第6期1298-1303,共6页
基金
公益性行业(农业)科研专项(201003031)
国家自然科学基金(31071660)
文摘
水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA,dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6个非结构蛋白分别为P5,P6,P7-1,P7-2,P9-1,P9-2。在非结构蛋白中,P5,P6和P9-1已被证实参与形成毒质结构,P7-1被认为可在细胞质中形成类似管状的结构作为病毒胞间扩散的通道,P7-2和P9-2的功能目前尚不明确。文章采用Pull-Down和液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)等技术来鉴定水稻蛋白(日本晴)与P7-2蛋白间可能存在的互作关系。通过Pull-Down实验分析,发现有4种水稻蛋白可与P7-2相结合,其中2个蛋白为转录相关蛋白,1个为氨基转移酶,还有1个为假定的分子伴侣60前体。实时荧光定量PCR分析显示,感病寄主中的转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体的表达量上调,而氨基转移酶的表达量降低。
关键词
水稻黑条矮缩病毒
p
7
-
2基因
原核表达
蛋白质互作
实时荧光定量
p
CR
Keywords
Rice black streaked dwarf virus
p7-2 gene
p
rokaryotic ex
p
ression
p
rotein interaction
real
-
time fluores
-
cence quantitative
p
CR
分类号
S435.111.1 [农业科学—农业昆虫与害虫防治]
下载PDF
职称材料
题名
RBSDV P7-2基因重组AcMNPV的构建及其对sf9细胞的致死作用
3
作者
刘龙
孙丽英
王敦
机构
西北农林科技大学植物保护学院
出处
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第1期81-87,共7页
基金
国家自然科学基金项目(31670659)
国家公益性行业(农业)科研专项(201404403-09)
文摘
[目的]为克服杆状病毒杀虫速度慢等固有缺点,首次尝试将异源病毒细胞凋亡诱导基因重组到昆虫杆状病毒中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。[方法]将带有SV40终止子的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)的P7-2基因依次插入到供体质粒p Fast Bac-HTB的多克隆位点。使用供体质粒p Fast Bac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2基因的表达。通过转座的方法将ph、P7-2基因及启动子插入到bacmid b MON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测P7-2基因的表达。转染sf9细胞后通过光学显微镜观察重组病毒多角体的形成并统计不同时间细胞死亡数量。通过TCID50的方法绘制病毒生长曲线。[结果]成功构建了P7-2基因重组AcMNPV bacmid Ac-P7-2,Western blot检测到P7-2蛋白可以正确表达。在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,重组病毒v Ac-P7-2细胞死亡数量显著高于野生型病毒v Ac-WT,并发现重组病毒v Ac-P7-2多角体形成并释放的速度也快于野生型病毒v Ac-WT。病毒的生长曲线显示,在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,v Ac-P7-2的增殖速度显著快于v Ac-WT。[结论]成功构建了多角体形成迅速的重组病毒v Ac-P7-2,与野生型病毒v Ac-WT相比其具有较快的增殖速度,对寄主细胞有较强致死作用。
关键词
RBSDV
p
7
-
2基因
重组AcMN
p
V
多角体形成速度
致死作用
Keywords
RBSDV
p7-2 gene
recombinant AcMN
p
V
s
p
eed of
p
olyhedra formation
lethal effect
分类号
S433.4 [农业科学—农业昆虫与害虫防治]
Q789Q965 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达
胡昱颛
王全兴
张金艺
宋水林
蒋军喜
熊桂红
《生物灾害科学》
2023
0
下载PDF
职称材料
2
四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析
张上林
孙丽英
陈剑平
《浙江农业学报》
CSCD
北大核心
2013
1
下载PDF
职称材料
3
RBSDV P7-2基因重组AcMNPV的构建及其对sf9细胞的致死作用
刘龙
孙丽英
王敦
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
0
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