p75神经营养蛋白受体基因敲除对小鼠面神经损伤后神经再生的影响

目的探讨p75神经营养蛋白受体(p75NTR)在面神经损伤后神经再生中的作用。方法对p75NTR基因敲除小鼠和野生型129sv小鼠的一侧面神经总干在神经出颅2mm处进行损伤,损伤后第2天,一部分小鼠在神经干损伤的近中侧注射霍乱毒素B(CTB)进行顺行示踪标记,损伤后3、7d,应用免疫组织化学方法对神经纤维再生轴突进行长度测定及记数分析。另一部分小鼠在面神经总干损伤后第4天切断神经,将切断的面神经断端置入含有FastBlue的聚氯乙烯单端小管中进行逆行示踪标记,荧光显微镜下对面神经核运动神经元进行计数分析。结果p75NTR基因敲除小鼠与野生型129sv小鼠相比较,再生的神经纤维轴突长度明显不足,二者间面神经核再生运动神经元数量差异有统计学意义(P<0.05)。再生轴突的免疫组织化学染色表明,p75NTR基因敲除小鼠再生的神经纤维轴突数量也明显降低(P<0.01)。结论p75NTR基因可以增强面神经的再生。

p75神经营养蛋白受体阳性舌鳞状细胞癌细胞的生物学特性研究

目的对流式细胞仪分选获得的p75神经营养蛋白受体(p75NTR)阳性舌鳞状细胞癌细胞进行生物学特性研究。方法通过流式细胞术检测舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113和Cal-27中p75NTR阳性细胞的表达。对流式细胞仪分选获取的p75NTR阳性细胞进行单克隆培养、四甲基偶氮唑盐比色法及划痕实验检测,以未分选细胞为对照,分析p75NTR阳性细胞的生物学特性。结果舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113、Cal-27中,p75NTR阳性细胞的比例分别为3.1%和1.9%。与未分选的细胞相比,p75NTR阳性细胞的单克隆形成能力更高(Tca-8113细胞,P=0.024;Cal-27细胞,P=0.009);单克隆p75NTR阳性细胞再培养2周后,p75NTR阳性细胞率分别降为14.5%(Tca-8113)和5.8%(Cal-27);p75NTR阳性细胞体外增殖能力显著增强,且具有明显的侵袭迁移能力。结论 p75NTR阳性舌鳞状细胞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。

GM1介导NGF对大鼠面神经核p75NGFR表达影响的研究

目的观察联合应用GM1和NGF时大鼠面神经核内神经元p75NGFR的表达情况,探讨GM1提高NGF在促进运动神经元再生方面的作用机制。方法健康成年SD大鼠24只,随机分为2组,每组12只:四周组和八周组。利用大鼠面神经再生室模型和免疫组化方法,结合细胞计数和灰度分析的手段,对大鼠面神经核内p75NGFR免疫阳性神经元进行观察。结果四周组和八周组的实验侧的p75NGFR表达阳性细胞数明显高于对照侧(P<0.01);四周组的p75NGFR阳性细胞数明显高于八周组(P<0.01)。面神经核p75NGFR阳性细胞灰度值无论四周组和八周组之间,还是实验侧与对照侧之间都没有显著性差异(P>0.05)。结论GM1可以通过抑制面神经核内p75NGFR阳性神经元的凋亡的机制强化NGF促进神经再生和成熟的作用。

p75NTR对小鼠面神经损伤后脑内神经元再生的影响

目的:探讨p75NTR在面神经损伤后面神经核运动神经元再生中的作用。方法:对p75基因敲除小鼠和野生型小鼠的面神经总干进行损伤,损伤后第4天,在面神经总干损伤的远中侧神经分叉处切断,将切断的面神经断端置入含有FastBlue的聚乙烯单端小管中进行后示踪标记,术后第7天冷冻切片后荧光显微镜下对面神经核运动神经元进行计数,然后进行统计分析。结果:两组之间再生的神经元数量有显著性差异(P<0.05)。结论:p75NTR可以促进面神经运动神经元的再生。

p75NTR对小鼠面神经损伤轴突再生影响的实验研究

目的:探讨p75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)在面神经损伤再生修复中的作用。方法:p75NTR基因敲除小鼠和野生型小鼠的面神经总干损伤后第4天,在损伤的近中侧注射霍乱毒素B(choleratoxin B,CTB)进行示踪,对再生神经纤维进行免疫组化染色,然后计数进行统计分析。结果:p75NTR基因敲除小鼠再生的神经纤维,明显较野生型小鼠的短,差异有显著性(P<0.01)。结论:p75NTR可以增强面神经的再生。

早期脑出血后细胞凋亡与p75NTR、TrkA的相关性研究

目的探讨p75NTR、Trk A在高血压脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage,HICH)早期的表达情况,初步阐明其与细胞凋亡的关系。方法收集20例HICH病人脑出血后早期血肿周围不同部位组织标本,分为血肿表面组、半暗带组、脑皮质下区组;并在三组中将标本按出血时间(>7 h、≤7 h)、出血量(>60 ml、≤60 ml)分组。采用免疫组化检测三组中p75NTR、Trk A的表达,TUNEL方法检测凋亡细胞率,统计分析p75NTR、Trk A及凋亡细胞的相关性。结果 TUNEL法检测结果 :脑出血后越靠近血肿凋亡细胞越多(P<0.01)。HICH早期越靠近血肿表面p75NTR表达增加(P<0.01),并与凋亡细胞率成正比(P<0.05);Trk A在脑出血后有表达,不同部位Trk A表达无差异(P>0.05),与细胞凋亡无明显关系(P>0.05)。血肿表面组p75NTR/Trk A比率较其余两组上升(F=4.851,P=0.011)。随着出血时间延长、出血量增加,p75NTR表达增加(P<0.05),而Trk A表达无变化(P>0.05)。结论 HICH早期病人p75NTR在Trk A低表达或者无活性环境中促进细胞凋亡,Trk A与细胞凋亡无相关,p75NTR/Trk A比率变化影响出血后细胞凋亡。

营养补偿和代谢控制提高细胞蛋白表达的研究

为解决连续灌注培养产物因营养物质不能有效利用而导致产率偏低的问题,降低生产成本,通过在发酵过程中测定表达重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc(TNFRp75:Fc)蛋白的CHO工程细胞株对氨基酸成分的不同消耗速率,定量添加特定氨基酸作为营养补偿,提高了培养基中氨基酸的综合利用效率。同时,在连续灌注过程中通过对葡萄糖补加的限量控制,使培养体系中葡萄糖始终低于0.5 g／L,减少了乳酸蓄积对细胞的毒性作用,从而有效降低了灌注速率。结果显示, 在30L工作体积发酵规模上经过氨基酸补偿和葡萄糖控制的连续灌注培养工艺使最终重组蛋白产率(mg／L)和最终产量较工艺改进前提高2．1倍和3．7倍,分别达到388mg／L和244．4g,生产周期延长了一周。工艺改进前后重组蛋白的唾液酸含量和体外生物比活没有改变。通过营养补偿和代谢控制工艺策略可以有效提高连续灌注培养工艺重组肿瘤坏死因子受体p75:Fc蛋白的产率和产能,从而降低产业化成本。

慢病毒介导沉默P75神经营养蛋白受体联合NGF过表达转染BMSCs复合脱钙骨基质异位成骨的实验研究

目的探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传代。取第3代BMSCs,分别用慢病毒介导沉默P75NTR基因(B组)、NGF过表达基因(C组)、沉默P75NTR和NGF过表达双基因(D组)转染,以未转染细胞作为对照(A组)。转染7 d后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达;细胞计数试剂盒8法检测转染后连续8 d细胞的活性;Western blot检测各组P75NTR和NGF蛋白表达。倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默P75NTR和NGF过表达双基因转染后BMSCs与DBM的黏附情况。将上述4组转染后BMSCs分别与DBM共培养制备组织工程骨后,埋植于8周龄SD大鼠背侧皮下构建皮下异位成骨模型(n=6),术后4、8周行HE染色,术后8周ALP染色观察钙结节形成,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达。结果转染7 d A组未见荧光表达,B组呈红色荧光表达,C组呈绿色荧光表达,D组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达70%左右。Western blot检测示,A、C组P75NTR蛋白相对表达量显著高于B、D组,C、D组NGF蛋白相对表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随时间推移,各组细胞增殖活性均上升,其中D组上升最明显,3~8 d细胞活性明显高于A组(P<0.05)。倒置相差显微镜和扫描电镜观察示,BMSCs能与DBM形成良好黏附。皮下异位成骨实验中,HE染色示术后4、8周,D组比其余3组有更多的骨组织形成。ALP染色示D组ALP活性最高,有更好的成骨表达。实时荧光定量PCR检测示,与A组比较,D组Runx2、ALP、OCN mRNA相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论沉默P75NTR联合NGF过表达双基因共转染BMSCs复合DBM构建组织工程骨具有良好的异位成骨能力,通过提高NGF的水平、关闭P75NTR凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好地促进骨组织再生。

神经生长因子研究新进展

目的：综述神经生长因子及其 P75受体与细胞凋亡的关系。方法：查阅国内外有关文献加以综述。结果：神经生长因子与 P75结合或独立的 P75可以传递死亡信号，最终导致细胞死亡。结论：神经生长因子和 P75参与并介导细胞凋亡。

HIV感染的部分病因及风险研究

Mayo大学临床病毒学家研究发现：一种特殊的人类蛋白LEDGF／p75（p75），对HIV整合进入人类基因起重要作用。研究者发现：HIV感染人类染色体时，必须靠p75蛋白搭桥链接。当HIV通过p75整合到宿主细胞基因后，就阻碍了人类对HIV的清除。经p75链接并整合进入宿主染色体的这部分基因将成为HIV遗传复制的根基。当患者处于健康状态时，这部分基因处于被抑制状态；但当人类的抗病毒机制被阻断或破坏后，这部分基因中的HIV就会产生永不休止的拷贝，并播散侵犯全身。

脑源性神经营养因子对施万细胞行为的影响

神经营养因子在神经系统的发育与维持中起着重要作用，脑源性神经营养因子（BDNF）就是其中重要的一员。BDNF与相应受体p75神经营养蛋白受体（p75NTR）／原肌球蛋白受体激酶（trkB）结合，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）／胞外信号调节激酶（ERK）、