水稻矮缩病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达

【目的】为明确水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV) Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达动态,【方法】利用PEG介导的病毒侵染原生质体体系,通过免疫荧光和电镜技术分析Pns6、P8蛋白以及病毒粒体在水稻原生质体中的定位;同时,通过Western blot和实时荧光定量PCR分析Pns6和P8蛋白及其RNA在水稻原生质体中的积累量。【结果】病毒接种水稻原生质体48h后,Pns6蛋白在细胞质中可以形成类似于病毒原质(viroplasm)的点状内含体,P8蛋白也大量的表达。同时,病毒粒体在水稻原生质体中也形成内含体状的结构。病毒接种水稻原生质体12 h后,均可检测到Pns6和P8蛋白的表达,并且在36 h后达到最高值。病毒接种水稻原生质体后,Pns6 RNA在24 h时表达量达到最高,P8 RNA在36 h时表达量达到最高。【结论】RDV侵染水稻原生质体后,Pns6和P8蛋白均有表达,并且病毒也可能通过形成病毒原质来完成病毒在寄主细胞的复制和装配。

重组斑马鱼p8蛋白的原核表达及纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法:PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni2+柱纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12.8×103。结论:获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。

肿瘤相关应激分子p8

p8是在研究急性胰腺损伤的分子机制中首先鉴定得到的一个小分子核蛋白。胰腺、肝脏、肾脏等诸多脏器受到损伤刺激后,p8能够在短时间内迅速、高水平地上调,被认为是一个应激分子。进一步研究显示,p8在包括胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌及前列腺癌等多种肿瘤中存在差异表达,并通过影响细胞的生长、凋亡及转移等过程参与肿瘤的发生、发展。但关于p8在肿瘤中的作用,不同研究的结果并不一致。我们简要综述p8在肿瘤中的作用。

水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6和外壳蛋白P8多克隆抗体的制备及其应用

利用RT-PCR的方法从感染水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)的水稻中克隆该病毒的运动蛋白基因S6和外壳蛋白基因S8,通过Gateway系统进行原核表达,获得表达载体p DEST17-Pns6和p DEST17-P8,将表达载体转化E.coli Rosetta,经IPTG诱导表达后获得分子质量约为59和46 ku含HIS标签的融合蛋白.以诱导表达的目的蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体.结果表明,Western blot检测制备的Pns6和P8抗体可特异性检测RDV,间接ELISA测定Pns6和P8抗体的效价均约为6 400倍,并建立了可靠、灵敏、特异的Dot-blot ELISA方法检测RDV.以上研究表明,RDV运动蛋白和外壳蛋白抗体均可应用于该病毒在田间的大规模调查和检测.

转录调节因子p8分泌表达载体的构建及在Fx293细胞中的表达

目的:构建可以产生分泌型转录调节因子p8重组蛋白的载体,期望进一步研究p8的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay表达载体中去除HA和Myc标记序列,保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源p8、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因。PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验。结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外转染Fx293细胞后产生重组蛋白。结论:成功构建体外可以产生p8的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的p8多肽和体外鉴定与p8结合的蛋白分子实验奠定基础。

感染赤霉病菌后小麦穗组织蛋白的氧化交联

为探究细胞壁组成蛋白在抗赤霉病中的作用,对接种赤霉病菌后小麦抗、感品种穗组织中离子结合型蛋白进行了分析。样品过氧化物酶比活力测定结果显示,高抗品种苏麦3号和望水白在接种赤霉病菌孢子后的6d内,过氧化物酶(POD)比活力明显高于对照,中抗品种扬麦158比对照也略有增加,而感病品种宁麦6号和安农8455则与对照无差异。用凝胶层析的方法分析了抗赤霉病程度不同的5个小麦品种穗组织盐溶成份。结果表明,2个高抗品种在接种病原物或过氧化氢处理后,洗脱体积为8ml的蛋白质(P8)的吸收峰明显增高,而在感病品种中P8蛋白变化不明显。高抗品种的对照样品在过氧化氢水浴(35℃)处理后,P8峰有所提高,表现出与赤霉病菌接种处理一致的趋势。

Nupr1在乳腺癌细胞中的作用机制研究

目的探讨Nupr1在乳腺癌细胞生长、凋亡和细胞周期进展中的作用。方法构建Nupr1siRNA慢病毒载体,沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞的Nupr1基因,抑制Nupr1的表达。以未做处理的细胞为空白对照组,以含与人类无同源性的序列RNAi为阴性对照组。流式细胞术检测细胞凋亡,以MTT法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞生长能力,Western blot法检测实验组细胞ki67和Survivin的表达。结果慢病毒介导的RNAi抑制了乳腺癌细胞Nupr1的表达,Nupr1沉默组MDA-MB-231细胞的凋亡明显增加,细胞增殖活力降低,Ki67及Survivin表达水平减低。结论在乳腺癌细胞中抑制Nupr1的表达可以降低细胞增殖能力,同时Nupr1在乳腺癌细胞增殖凋亡中起重要作用;提示Nupr1基因沉默可能是治疗乳腺癌的一种很有前途的靶点,需要我们进一步深入研究。

水稻黑条矮缩病毒p8蛋白的原核表达、抗血清制备及其特性

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)p8蛋白由其基因组片段S8编码,根据RBSDV浙江分离物S8序列(AJ297431)设计特异性引物扩增编码p8蛋白N端部分的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-32a+,然后以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平地表达,利用纯化的p8蛋白免疫小鼠,制备了p8蛋白的特异性抗血清。Western blot分析表明,p8蛋白在水稻病株中含量较为丰富,易于检测,而且p8蛋白参与病毒粒子的组成,表明p8是一个病毒结构蛋白。ELISA检测显示p8蛋白的抗血清可与不同来源的水稻、小麦、玉米病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于RBSDV田间病株的快速诊断。

水稻瘤矮病毒P8蛋白的结构分析及其表达

为揭示水稻瘤矮病毒(RGDV)外层衣壳蛋白P8的结构特点及其在大肠杆菌中的表达特性。利用生物学软件和在线分析工具,对RGDVP8蛋白结构特征进行了生物信息学分析;同时将通过RT-PCR扩增的P8基因克隆到pGEX-4T-1上,构建pGP8转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下表达。利用表达的融合蛋白免疫家兔,制备了抗血清,并以RGDV、水稻矮缩病毒(RDV)、水稻条纹病毒(RSV)、水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)4种病毒作为供试材料进行特异性检测。分析显示P8蛋白在C端位置有一个典型的跨膜螺旋区,整个蛋白也具有Phytoreo P8家族共有的典型结构域Phytoreo P8 domain。SDS-PAGE和蛋白印记分析表明,RGDVP8融合蛋白分子量约为73kDa,以包涵体的形式获得了高效表达。获得的效价高、特异性强的抗血清,为水稻瘤矮病毒的快速检测及P8蛋白的功能研究奠定了基础。

乳腺癌组织核蛋白1/p8表达临床意义及其与分子分型的关系

目的核蛋白1／p8（nuclear protein1／p8，nupr1／p8）作为转录调节N子，在多种肿瘤中的表达发生了变化。本研究旨在研究乳腺癌组织中nupr1／p8的表达情况，及nupr1／p8的表达与乳腺癌分子分型、临床病理特征的关系及其意义。方法采用免疫组化法检测河北大学附属医院乳腺科2008—01—01—2012-12-01收治的93例乳腺癌组织中nupr1／p8的表达情况，收集同期该院30例非典型导管增生组织和20例良性乳腺病变为对照组，并分析其表达与乳腺癌临床病理学特征（包括肿瘤分级、病理学分期、淋巴结转移、分子分型等）的关系。结果乳腺癌组织中nupr1／p8表达率为63．4％（59／93），显著高于对照组20．0％（10／50），差异有统计学意义，x2=24．57，P〈0．001；浸润性乳腺癌组织中nupr1／p8表达与淋巴结转移（x2=7．75，P=0．005）及分期（x2=33．08，P〈0．001）有关。淋巴结转移阳性组nupr1／p8高表达率为75．6％（34／45），显著高于淋巴结阴性组43．2％（16／37）；Ⅲ期乳腺癌nupr1／p8高表达率为82．6％（19／23），显著高于Ⅰ期55．6％（10／18，x2=4．24，P=0．039）及Ⅱ期51.2％（21／41），x2=6．19，P=0．013。不同分子分型的浸润性乳腺癌淋巴结转移率不同，x2=13．59，P=0．004。人表皮生长N子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）型淋巴结转移率为70．6％（12／17），显著高于LuminalA型41．7％（15／36），x2=3．86，P=0．049；不同分子分型的乳腺癌nupr1／p8高表达率不同，x2=10．09，P=0．018。三阴性型nupr1／p8高表达率为83．3％（15／18），显著高于LuminalA型47．2％（17／36，x2=6．29，P=0．012）及LuminalB型45．5％（5／11，x2=4．58，P=0．032），HER2型nupr1／p8高表达率为76．5％（13／17），显著高于LuminalA型，x2=4．02，P=0．044。Nuprl／p8的表达与不同月经状态、组织学类型、组织学分级及肿瘤大小无关，均P〉0．05。结论nupr1／p8在乳腺癌组织中高表达率升高，提示它在乳腺癌发展中可能起重要作用；在肿瘤进展期，nupr1／p8高表达与淋巴结转移及肿瘤分期呈正相关，且与分子分型及预后不良相关，推测nupr1／p8在肿瘤的预后判断中可能为独立因素，检测nupr1／p8的表达水平可能作为乳腺癌预后判断的有用指标。

p8-应激调节的多功能核蛋白

1997年,Iovanna等在研究急性胰腺损伤的分子变化中首先克隆得到了p8基因。人的p8分子是一个由82个氨基酸组成的小分子核蛋白,分子内含有一个保守的核定位序列,蛋白质二级结构与HMG-I/Y蛋白十分相似,该分子在包括胰腺、肝脏、肾脏在内的诸多脏器受到损伤刺激后,能够在短时间内迅速、高水平地上调,因此被认为是一个应激分子(stress associated protein)。随后的研究显示该基因具有复杂的表达调节模式,在个体发育、肿瘤形成、组织损伤、心肌肥大以及糖尿病性肾病中都发挥重要作用,并且其功能表现在不同组织、细胞中不尽相同。

核内蛋白P8与内分泌肿瘤的研究进展

核内蛋白P8是一种应激蛋白，其分子结构及生化功能与羟甲戊二酸单酰CoA（HMG）-I／Y蛋白类似，参与甲状腺癌、垂体瘤等的发生、发展及转移。P8可通过上调转化生长因子（TcF）β1、下调P27蛋白等作用促进肿瘤生长，同时促进肿瘤种植、转移。对于P8的深入研究，有助于阐明内分泌肿瘤发病机理及抗肿瘤新药的研发。

SRBSDV P8蛋白的多克隆抗体制备及其应用

克隆了南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的核心蛋白P8基因,并利用Gateway原核表达系统,将P8基因构建到原核表达载体pDEST17上,经转化大肠杆菌表达菌株Rosetta细胞,通过IPTG诱导P8蛋白表达。以原核表达的P8蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western blotting检测,结果显示抗体能够特异性地结合P8蛋白。Dot-ELISA分析表明,制备的P8抗体能够检测感染SRBSDV的水稻植株。间接ELISA分析表明,抗体滴度为1∶3 200。说明本实验所制备的抗体可用于田间南方水稻黑条矮缩病的检测,同时也为研究SRBSDV P8蛋白的功能及其与昆虫和寄主之间的互作奠定了基础。