绵羊肺炎支原体新疆流行株的分离鉴定及其膜蛋白P80基因序列分析

本研究对新疆沙湾县疑似绵羊肺炎支原体(MO)感染的病料进行病原的分离鉴定,并对分离株进行形态学、生化和分子生物学鉴定。分离鉴定出MO13株,提取MO分离株的基因组,经PCR技术扩增MO分离株膜蛋白P80基因,将扩增序列与Gen Bank中已知的MO法国14811株膜蛋白P80基因序列进行比较。结果表明,该序列核苷酸的同源性为97.11%,推导氨基酸序列的同源性达到98.28%。该基因存在60处碱基突变,其中24处是同义突变,36处为错义突变,表明MO不同地域分离株膜蛋白P80存在一定的遗传变异。

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻（BVD）鉴别诊断ELISA方法，采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段，分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上，获得了重组质粒pGEX-6PI-p80A、pGEX-6PI-p80B和pGEX-6P1-p80C，将其分别转化感受态茵Rosetta和BL21，经1．0mmol／L的IPTG诱导，分别得到大小为60、47和51ku的目的蛋白。经Western-blotting分析，3个目的蛋白中，只有p80B（289～477aa）基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应，表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。

猪瘟病毒p80基因丝氨酸蛋白酶功能区的原核表达及小鼠免疫试验

根据已发表的猪瘟病毒Alfort株的全基因组序列,设计2对引物以Shimen细胞毒株为材料,一步法提取总RNA,利用RT-PCR和套式PCR,成功扩增出p80全长基因,包括丝氨酸蛋白酶以及NTPase/RNA解旋酶功能区,大小约为2.0kb。将p80基因中的丝氨酸蛋白酶基因克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒pET-p80。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达得到分子量约为43ku的目的蛋白,与理论大小相符。将菌体蛋白经Ni柱纯化,获得纯化重组p80蛋白,Western blot检测表明,表达的目的蛋白能与CSFV阳性血清发生反应。用纯化的p80蛋白免疫Bal b/c小鼠,成功制备了抗p80蛋白的抗血清。

猪瘟病毒p80基因NTPase/RNA解旋酶功能区在E.coli中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒GXYL株和C株p80基因的NTPase/RNA解旋酶功能区(sGXNS3和sCNS3),将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-sGXNS3和pET-sCNS3。PCR、酶切和序列分析鉴定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确。1 0mmol/LIPTG诱导得到分子量为26kD的目的蛋白,Westernblot检测表明,表达的目的蛋白能被CSFV阳性血清识别。

猪瘟C-株和野毒株p80基因的序列分析

利用RT PCR及nPCR技术扩增出了C 株兔脾组织毒和广西玉林野毒 (GXYL) p80基因的一段长 94 2bp的序列 ,并将其克隆到PMD 18T载体中 ,测定其核苷酸序列并推导出了相应的氨基酸序列。比较C 株、GXYL株和已发表的Alfort株、Brescia株相应核苷酸序列及氨基酸序列同源性 ,核苷酸同源性最低为 87.4 6% ,最高为 98.0 8% ;氨基酸同源性最低为 94 .2 7% ,最高为 98.0 9%。

同安钮夜蛾核型多角体病毒pst I-G片段克隆及序列分析

【目的】测定同安钮夜蛾核型多角体病毒(OpdiNPV)pst I-G片断的序列,了解OpdiNPV的遗传结构和与其它昆虫病毒的进化关系。【方法】用pstⅠ酶切病毒基因组,电泳分离并回收pst I-G片段,连接到PUC18,转化入E.coli DH 5α,挑取阳性菌落测序。【结果】该片段长度为5056bp,有4个ORF,分别编码ODV-E66的C末端(EU 623602),P87/VP80的C末端(EU 732665),ODV-Ec43(EU 617337)和Ac108(EU 732666)。ac108基因和odv-ec43起始密码子上游都有1个晚期启动子结构域TAAG,odv-ec43基因起始密码子上游有2个早期转录起始元件CAGT;由odv-ec43推导的蛋白有2个跨膜螺旋、3个N-糖基化位点、1个N端酰基化位点、7个PKC磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和4个CKⅡ磷酸化位点;p87/vp80基因终止密码子下游有polyA信号。【结论】氨基酸序列同源分析和相似性分析显示Ac108、ODV-E66和P87/VP80与其它昆虫病毒差异较大,ODV-Ec43的保守性较高。

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。