不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对,分析3种疫苗菌株和4个标准株之间核苷酸及氨基酸差异。结果发现,疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%,与J株、232株相似性为99.1%,与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%;而与疫苗株168株相似性为97.5%;三个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%,差异主要发生在R1区重复序列的次数上。本研究为临床猪支原体肺炎活疫苗菌株的检测及不同菌株之间的差异鉴定研究奠定了基础。

猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达

通过引物定点突变PCR法,扩增了猪肺炎支原体(Mhp)168株黏附因子P97基因抗原决定簇R1区基因片段,并将该基因片段插入表达载体pET-32 a(+)中构建重组质粒,再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。DNA序列分析结果表明所构建的重组质粒含有正确的目的基因。经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h,重组质粒表达的目的蛋白量可达到总蛋白的23%。W estern b lotting和ELISA试验结果证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性。

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白DnakC末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6h。用BugBusterTMNi-NTA His.Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性。

猪肺炎支原体P97基因特异性随机肽库的构建与初步筛选

构建猪肺炎支原体(Mhp)P97基因特异性随机肽库,探索从中筛选Mhp抗原表位的可行性。PCR扩增获得Mhp P97基因的部分C-端序列,产物用DNaseⅠ消化后将回收的P97随机片段(50 bp^100bp)克隆到pC89pⅧ型噬菌粒载体中,转化XL1-blue感受态细胞,辅助噬菌体VCSM13超感染,获得MhpP97基因特异性噬菌体随机肽库。经过三轮亲和筛选,有效地富集了噬菌体阳性克隆。结果显示,所建肽库的容量约为1.8×104,滴度约为1.3×1012pfu/mL。随机挑取10个阳性克隆进行ELISA检测,结果显示除1号孔外均为阳性。

猪肺炎支原体P97基因随机肽库的构建

目的:构建能用于抗原表位筛选的猪肺炎支原体(Mhp)P97基因C-端序列噬菌体随机肽库。方法:以MhpZ株(强毒)基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得MhpP97基因的C-端部分序列,扩增产物用DNaseⅠ消化并回收50bp^100bp的随机片段,将回收的随机片段插入pC89pⅧ型噬菌粒载体中,转化大肠杆菌XL1-Blue,辅助噬菌体VCSM13超感染,使P97基因随机片段以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面,从而成功构建了P97基因特异性噬菌体随机肽库。用PCR及DNA测序法鉴定所建文库的随机性和多样性,测定肽库的滴度并计算库容量。结果:所建肽库的容量约为1.8×104,滴度约为1.3×1012TU/mL,PCR检测及DNA测序结果显示插入片段具有随机性和多样性。结论:所建随机肽库具有较好的随机性和多样性,能够满足后续的抗原表位筛选,为进一步的深入研究奠定了基础。

Mhp强弱毒株P97基因的克隆与序列测定

利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增出猪肺炎支原体弱毒株R659及强毒株F19的P97基因,PCR产物经纯化后,克隆至载体pGEM-Teasyvector,转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒,对目的片段测序,结果表明:R659的P97全基因大小为3416bp,F19的P97全基因大小为3329bp,强弱毒株间核苷酸同源性为96.9%,弱毒株R659与标准株232A核苷酸同源性为95.6%,强毒株F19与232A株核苷酸同源性为95.1%。

贵州省地方猪肺炎支原体鉴定及其主要黏附因子基因序列分析

为了了解贵州地方猪肺炎支原体菌株遗传变异情况,试验对3份贵州省贵阳市某地方猪养殖场疑似感染猪肺炎支原体的病料进行离体培养及PCR鉴定;同时对分离菌株及6株疫苗菌株的主要黏附因子P46基因、P97基因R1区和P146基因高变区进行PCR扩增及测序,并与参考菌株比对分析,挖掘分离菌株与疫苗菌株、参考菌株之间的差异性。结果表明:从疑似病料中培养并鉴定获得1株猪肺炎支原体,命名为GZ株。GZ株P46基因核苷酸序列与疫苗菌株、参考菌株的同源性最高,均在98.3%以上。P146蛋白高变区氨基酸差异主要发生在PQ和PS重复区,GZ株PQ重复区中只缺失2个氨基酸,而PS重复区中缺失7个氨基酸,与疫苗菌株168L株、RM48株和Z株缺失情况一致。GZ株P97基因R1区核苷酸序列与疫苗菌株、参考菌株之间的同源性低,为94.5%~97.4%;各菌株间P97蛋白R1区氨基酸序列中,AAKPV/E重复基元存在不同程度缺失,GZ株在该区域仅存在5个重复基元,且第1个重复序列中的谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)。说明P97蛋白R1区和P146蛋白高变区氨基酸序列的改变导致抗原表位和黏附能力发生变化,对P97基因R1区和P146基因高变区遗传变异情况的调查将有助于筛选出最佳商品化疫苗和研制地方性适用疫苗,有效阻止肺炎支原体在猪群中的传播。

猪肺炎支原体P97 TaqMan-BHQ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据猪肺炎支原体(Mhp)P97基因的保守序列设计合成了引物和TaqMan-BHQ探针,建立了快速检测Mhp的TaqMan-BHQ荧光定量PCR方法。结果显示,该方法特异性良好,与其他病原不发生交叉反应;最低检测限可达10copies/μL,敏感性高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间的线性关系表达式为Ct=-3.426×lg(conc)+43.343,有良好的线性关系,标准曲线的相关系数为0.997,扩增效率为95.85%,重复性良好。对江苏省某猪场的48份猪肺组织进行荧光定量PCR检测,结果有43份肺组织呈现阳性,阳性检出率为89.58%,比巢式PCR的敏感性高。表明,该检测方法能用于Mhp的快速检测,可对猪支原体肺炎的早期诊断和流行病学调查提供新的技术手段。

猪肺炎支原体p97 C末端基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

【目的】构建携猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)黏附因子p97C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,该重组穿梭质粒经PmeI线性化后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组获得重组腺病毒DNA,纯化后的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞以获得重组腺病毒。对该重组腺病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定,用氯化铯密度梯度离心纯化试剂盒对该重组腺病毒进行纯化并确定其滴度。重组病毒经肌注、滴鼻两种途径免疫小鼠并从体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫3个方面对其免疫结果进行分析。【结果】PacⅠ酶切证实同源重组成功,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定证明了该重组腺病毒成功转录并表达了p97C末端蛋白,将该重组病毒进行纯化后滴度可达到5×1011TCID50/mL,重组病毒可诱导小鼠产生血清、肺匀浆液特异性IgG,通过滴鼻免疫方式还可诱导肺匀浆液SIgA的产生,但不能诱导特异的淋巴细胞增值。【结论】成功构建了表达p97末端基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的的体液免疫和粘膜免疫,但不产生细胞免疫应答。