猪肺炎支原体p97蛋白研究进展

p97蛋白是猪肺炎支原体表面的黏附因子,是主要的致病物质,它可以刺激机体首先产生抗p97的IgA和IgM,且这些抗体比其他相关抗体早产生30d^60d。研究表明,p97具有良好的免疫原性,采用p97作为猪肺炎支原体的早期诊断和疫苗研制靶标具有重要意义。论文对p97的分子结构特征和免疫原性等进行了系统阐述,以期为猪支原体肺炎诊断试剂盒和疫苗的研制提供参考。

利用酵母随机展示技术对猪肺炎支原体P97上B细胞表位的筛选和鉴定

构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250bp的片段,回收产物经3′端加A处理后与用XcmⅠ酶切的酵母表达载体pCT-XcmⅠ连接,将连接产物转化酿酒酵母EBY100获得P97蛋白酵母随机展示文库。利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与Mhp天然感染的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆,并进一步鉴定其最小抗原表位。结果:1)克隆计数显示构建的随机文库库容量为2.86×106克隆,所有插入的片段随机分布,覆盖了全长的p97突变基因,文库经诱导后可以利用流式细胞仪检测到与Mhp天然感染的猪阳性血清反应的阳性克隆;2)随后对文库进行流式细胞分选,经鉴定选出184号一个抗原多肽。从短肽C端氨基酸逐个缺失后发现长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽为一个B细胞表位,该表位能与多份Mhp阳性猪血清反应。P97蛋白酵母随机展示文库可以用于抗原表位的筛选鉴定,184D多肽是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位,本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。

猪肺炎支原体JM株的分离鉴定及主要抗原蛋白基因序列分析

为了对从广东地区若干个屠宰场采集的164份疑似猪肺炎支原体感染的猪肺脏组织进行猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHp)的分离鉴定,并了解其主要抗原蛋白基因的遗传变异特点,试验先对采集的肺脏组织进行16S rRNA基因PCR检测,阳性样本进行病原的分离培养、形态学观察、双重PCR鉴定、分离株主要抗原蛋白膜蛋白P46全基因与黏附蛋白P97基因R1R2区序列分析及效价的测定。结果表明:164份临床样本经16S rRNA鉴定后102份为MHp阳性,阳性率为62.2%;阳性样本接种江苏二号(KM)液体培养基生长良好,颜色呈规律性变黄,在固体培养基上均能呈现特异性菌落形态;各代次分离菌株经16S rRNA双重PCR鉴定均能获得3个大小约1000 bp的目的条带,测序结果与国内外MHp各参考株核苷酸相似性为96.42%~98.21%,说明3株分离株均属于MHp,且可稳定遗传,分别命名为JM-24、JM-39、JM-44,分离株生长效价可达1×10CCU/mL;3株分离株主要抗原蛋白P46全基因和P97基因R1R2区与各参考株核苷酸相似性分别为96.0%~99.3%、97.8%~99.1%,其中P46全基因与参考株核苷酸同源性最高的为ES-2L株(登录号为CP058578.1),最低的为168株(登录号为CP002274.1)、168-L株(登录号为CP003131.1)、GDZJ01株(登录号为KF032627.1);P97基因R1R2区与参考株核苷酸同源性最高的为F7.2C株(登录号为CP034597.1),同源性最低的为168/GDZJ01株,P97基因R1R2区与国内外各致病菌株演绎的氨基酸序列同源性为72.3%~96.9%,其中分离株JM-44氨基酸序列在128~150位点存在缺失或变异,P46基因与P97基因R1R2区系统发育分析结果均表明JM-44分离株与国内外标准株及疫苗株(J株/168株)亲缘关系较远。说明我国广东地区MHp流行株与目前市场疫苗流行株遗传变异较大,提示现有疫苗对猪支原体肺炎的保护率可能下降。