T3SS通过ERK/ROS信号通路促进铜绿假单胞菌侵袭肺上皮细胞的作用

目的探究Ⅲ型分泌型系统(type three secretion system,T3SS)在调控铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)侵袭肺上皮细胞中的作用及具体机制。方法采用PA菌株感染人非小细胞肺癌A549细胞,分为未处理组、PAO1(PA实验室标准菌株)组、△exsA(缺失与T3SS转录激活相关的基因exsA)组、△pscJ(缺失与T3SS蛋白分泌相关基因pscJ)组和PAO1-E(经EGTA诱导后高表达T3SS基因)感染组。采用U0126抑制A549细胞ERK活性或通过apocynin(APO)/N-acetyl-L-cysteine(NAC)抑制A549细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生并随后感染PAO1或PAO1-E菌株,分为未处理组、PAO1或PAO1-E感染组、抑制剂处理组,以及抑制剂联合PAO1或PAO1-E感染组。选用庆大霉素杀伤胞外细菌并将细胞裂解液倍比稀释后涂布PA筛选平板,通过计数菌落形成单位(CFUs),明确PA感染后细胞内的细菌量;通过荧光探针标记以及流式细胞术检测感染后细胞内ROS水平;通过Western blot检测感染后ERK通路的活化情况。结果与PAO1感染组相比,△exsA和△pscJ感染组的细胞内细菌量减少(P<0.05,P<0.01),且伴随ROS产生减少(P<0.01),而PAO1-E感染组则呈现相反趋势(P<0.01)。PAO1或PAO1-E感染联合APO/NAC处理组的细胞内细菌量明显低于PAO1或PAO1-E感染组(P<0.01)。相较PAO1感染组,△exsA和△pscJ感染组的ERK磷酸化水平增加(P<0.01),而PAO1-E感染组的ERK磷酸化降低(P<0.01)。与PAO1感染组相比,PAO1联合U0126处理组的细胞ERK磷酸化水平降低,伴随ROS产生以及细胞内细菌量增加(P<0.01)。结论T3SS介导ERK通路抑制可通过促进肺上皮细胞ROS产生,增加PA对肺上皮细胞侵袭。

miR-142-5p通过影响上皮间质转化抑制肺腺癌H1650细胞的侵袭与迁移

目的:探讨肺腺癌组织中miR-142-5p的表达及其对H1650细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelieal-mesenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。方法:收集2014年1月至2015年1月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的107例肺腺癌患者的癌组织及其癌旁组织标本,以及人肺腺癌细胞系H1650、HCC827、A549、H1975、PC9和人支气管上皮细胞BEAS-2B,用qPCR实验检测肺腺癌组织及细胞中miR-142-5p的表达水平及其与患者临床特征的关系。分别用miR-142-5p模拟物(mimics)、miR-阴性对照质粒(miR-NC)转染H1650细胞后,用CCK8、细胞划痕愈合和Transwell侵袭实验分别检测H1650细胞的增殖、侵袭和迁移能力。使用生物信息学工具预测miR-142-5p的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p对靶基因的调控作用,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)及EMT相关蛋白的表达水平。结果:肺腺癌组织及细胞系中miR-142-5p表达水平显著低于癌旁组织及BEAS-2B细胞(均P<0.01);107例肺腺癌组织中,61例(57.01%)低表达miR-142-5p,其表达水平与患者的TNM分期、淋巴结转移密切相关(均P<0.01)。转染miR-142-5p模拟物后,H1650细胞中miR-142-5p高表达,细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著降低(均P<0.05或P<0.01)。生物信息学工具预测CDK5是miR-142-5p的靶基因,经双荧光素酶报告基因验证,miR-142-5p可显著降低H1650细胞中CDK5的表达水平,显著提高E-cadherin表达,降低N-cadherin和Snail的表达水平(均P<0.01)。结论:miR-142-5p在肺腺癌组织和细胞中呈低表达状态,其通过下调CDK5表达影响EMT抑制H1650细胞的侵袭与迁移能力。

钙信号转导途径介导肺炎链球菌侵袭人肺Ⅱ型上皮细胞

用F actin特异性FITC phalloidin荧光染料 ,观察肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae)作用A54 9细胞前后的F actin细胞骨架重排情况 ;用细胞松弛素D预处理A54 9细胞 ,观察肺炎链球菌对A54 9细胞的侵袭率 ;使用Datrolene预处理A54 9细胞 ,观察其与F actin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系 ;用Fura 2 AM荧光探针负载A54 9细胞后测定肺炎链球菌粘附A54 9细胞后的胞内Ca2 +浓度。结果发现肺炎链球菌作用A54 9细胞后 ,F actin细胞骨架呈块状、丝状聚集 ;而松弛素D可明显降低肺炎链球菌对A54 9细胞的侵袭率 ;肺炎链球菌粘附A54 9细胞后胞内Ca2 +高于对照 ;Datrolene可部分抑制A54 9细胞F actin细胞骨架重排 ,且与F actin细胞骨架重排百分率间存在量效关系。以上结果提示肺炎链球菌可通过Ca2 +细胞信号转导途径触发A54 9细胞F actin细胞骨架重排 ,进而导致肺炎链球菌侵袭A54 9细胞。

上皮间充质转化对肺鳞状细胞癌侵袭和迁移能力的影响

目的:研究肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LSCC)上皮间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的临床意义,并阐述EMT对肺鳞癌侵袭转移能力的影响。方法:对79例肺鳞癌组织切片进行E-cadherin、Vimentin及TGF-β1的免疫组织化学染色,分析其临床意义。将肺鳞癌细胞系SK-MES-1置于含有不同浓度转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)的培养基中,分别诱导培养5、10 d后,利用Western blot、RT-PCR检测E-cadherin、Vimentin的表达变化,以划痕、侵袭实验来判断不同浓度、诱导时间对SK-MES-1细胞功能的影响。结果:肺鳞癌发生淋巴转移病例中E-cadherin表达较未发生淋巴转移者低,而Vimentin表达则高于未发生淋巴转移的病例,差异具有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1阳性表达与淋巴结转移相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot和RT-PCR显示10 ng/m L TGF-β1诱导培养的SK-MES-1细胞中,Vimentin表达增强明显,E-cadherin表达减弱。细胞划痕和侵袭实验结果表明SK-MES-1经诱导后,迁移和体外侵袭能力增强。结论:肺鳞癌的淋巴转移与上皮间充质转化有关,TGF-β1可诱导肺鳞癌细胞发生EMT,增强其侵袭和迁移的能力。

沉默NGAL基因对肺癌细胞迁移及侵袭的影响

背景与目的检测NGAL在肺癌组织的表达,观察小干扰RNA(si RNA)沉默NGAL基因表达对肺癌细胞增殖及侵袭能力的影响。方法应用免疫组织化学检测肺癌组织中NGAL表达。通过RNAi技术干扰NGAL后,运用定量PCR、Western blot技术,观察干扰NGAL基因效率。干扰NGAL后,MTT检测细胞增殖、Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力,细胞划痕愈合能力,免疫荧光及Western blot方法检测上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关的蛋白E-cadherin及Vimentin的表达情况。结果肺癌中NGAL阳性率高于癌旁组织(P<0.01)。NGAL-si RNA转染组,癌细胞中NGAL基因及蛋白水平表达都受到明显的抑制。NGAL-si RNA转染组细胞增殖能力,迁移及侵袭能力相对于对照组都降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。干扰NGAL,E-cadherin的表达升高,Vimentin的表达水平降低。干扰NGAL,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低。结论 NGAL在肺癌组织高表达,且在肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移及EMT过程中起着重要作用。NGAL可能是肺癌浸润和转移的一个重要参考指标,可为肺癌治疗提供潜在的靶点。

阿帕替尼对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响

目的观察阿帕替尼对非小细胞肺癌细胞株A549及H460侵袭能力及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法通过细胞存活实验筛选阿帕替尼适宜剂量,通过Transwell检测其对细胞侵袭能力的影响,通过光学显微镜观察细胞的形态学变化,通过Western blotting检测EMT相关蛋白的变化。结果在A549及H460细胞中加入不同浓度的阿帕替尼,当阿帕替尼的浓度≤120 nmol·L-1时,细胞的存活能力没有明显改变。在60及120 nmol·L-1阿帕替尼作用下,A549细胞侵袭能力降低,并发生间质-上皮转化的形态学变化,EMT相关的E-cadherin表达升高,Vimentin、N-cadherin及Snail的表达降低。结论阿帕替尼可诱导非小细胞肺癌细胞株A549及H460由间质表型向上皮表型转化,并抑制细胞的侵袭能力。

ALX1基因过表达促进非小细胞肺癌细胞系PC-9上皮间质转化

目的:探讨ALX1(aristaless-like homeobox 1)基因过表达对非小细胞肺癌细胞系PC-9上皮间质转化(EMT)能力的影响。方法:构建pc DNA3.1-ALX1过表达重组载体,将pc DNA3.1-ALX1和pc DNA3.1分别转染PC-9细胞;采用细胞划痕实验和Transwell实验分析PC-9细胞迁移及侵袭能力的改变,用qRT-PCR和Western印迹法检测EMT过程相关标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)以及转录因子slug和snail表达水平的改变。结果:与对照组相比,ALX1过表达组中PC-9细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P<0.001),ZO-1表达量明显降低(P<0.05),N-cadherin、slug和snail表达量明显增高(P<0.001)。结论:ALX1基因过表达能够促进非小细胞肺癌细胞PC-9的EMT转化,其机制可能与ZO-1表达量下调和N-cadherin、slug和snail表达量上调有关。

PEDF对肺鳞状细胞癌SK-MES-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的:探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对肺鳞状细胞癌(鳞癌)SK-MES-1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响,阐明PEDF与肺鳞癌发生发展的关系。方法:培养SK-MES-1细胞,设不加PEDF的细胞为阴性对照组,PEDF干预组细胞分别加入180、360和720nmol·L-1 PEDF;MTT法检测各组SK-MES-1细胞增殖抑制率,细胞侵袭实验测定阴性对照组和720nmol·L-1 PEDF干预组SK-MES-1细胞穿透数,倒置显微镜观察各组SK-MES-1细胞形态学,流式细胞术检测各组SK-MES-1细胞凋亡率。结果:PEDF干预组细胞增殖抑制率均显著高于阴性对照组(P<0.01),不同剂量PEDF干预组间比较差异也有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组细胞贴壁生长良好,PEDF干预组细胞排列逐渐稀疏,形态改变明显。720nmol·L-1 PEDF干预组SK-MES-1细胞穿透数(31.6±15.8)低于阴性对照组(75.4±19.3),差异有统计学意义(P<0.01)。随着PEDF干预剂量增加,细胞凋亡率逐渐升高,不同剂量PEDF干预组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:PEDF抑制SK-MES-1细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡,对肺鳞癌生长和转移发挥对抗效应。提示PEDF可能成为肺鳞癌患者预后判定、抗癌治疗的有效因子。

小檗碱对肺炎链球菌侵袭A549细胞的保护作用

目的:通过体外实验,研究小檗碱是否对肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)侵袭人肺Ⅱ型上皮细胞(A549)有保护性抑制作用。方法:用不同浓度的小檗碱预处理A549细胞,并与S.pn一起与A549细胞共同作用,通过用0.025%的Triton X-100裂解细胞,然后将稀释后的裂解液涂布TSAB平板,培养过夜,计数平板上的菌落数。结果:小檗碱的浓度为0,25,50,100,200μg/mL时,S.pn对24孔板上每孔A549细胞的侵袭数分别为52±21,29±11,13±10,0,0;在其浓度终浓度为100μg/mL时,未得到可测的细菌数。结论:小檗碱可抑制S.pn侵袭A549细胞,两者间存在剂量依赖关系。

芦荟大黄素对人肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架的保护作用

目的 了解芦荟大黄素 (aloe emodinAE)对肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae,S pn)侵袭人肺Ⅱ型上皮细胞A5 4 9后微丝肌动蛋白 (filamentousactin ,F actin)细胞骨架是否具有保护作用。方法 采用F actin特异性荧光染料 phalloidin观察S pn作用A5 4 9细胞前后的F actin细胞骨架重排情况 ,并用芦荟大黄素 (aloe emodin ,AE)预处理A5 4 9细胞后观察其与F actin细胞骨架重排的关系。结果 用AE预处理A5 4 9后S pn侵袭数为 (2 2±4 )CFU/孔 ,而没有用AE预处理的A5 4 9S pn侵袭数为 (138± 2 1)CFU/孔 ,经两样本均数t检验 ,有显著差异(P <0 0 1)。结论 AE对S pn侵袭人肺Ⅱ型上皮细胞A5 4 9F

Hck基因通过EGFR通路对肺腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨造血细胞激酶(Hck)基因对肺腺癌A-549细胞增殖和侵袭的影响及机制。方法利用干扰和过表达Hck质粒转染A-549细胞,用MTT法检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,细胞划痕试验检测细胞迁移能力,RT-PCR法检测Hck和上皮生长因子受体(EGFR)mRNA表达水平,Western blot法检测Hck和EGFR蛋白表达水平。RT-PCR法检测18例临床肺腺癌组织和癌旁组织中Hck和EGFR mRNA表达水平,Pearson法分析Hck mRNA和EGFR mRNA的相关性。结果过表达Hck后A-549细胞增殖能力、侵袭能力和迁移能力均升高(P <0.05),EGFR mRNA和蛋白表达水平也有所升高(P <0.05);干扰Hck表达后A-549细胞增殖能力、侵袭能力和迁移能力均下降(P <0.05),EGFR mRNA和蛋白表达水平也对应降低(P <0.05)。肺腺癌组织Hck和EGFR mRNA的相对表达量均高于癌旁组织。Pearson相关性分析结果显示,癌组织中Hck mRNA与EGFR mRNA的表达呈正相关(r=0.555,P=0.017)。结论本研究发现Hck可能通过改变EGFR的表达水平调节肺腺癌细胞的生物学功能。

薯蓣皂苷通过调控PI3K/AKT信号通路抑制人肺腺癌细胞H1299上皮间质转化

目的研究薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)对人肺腺癌细胞H1299上皮间质转化的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用不同浓度Dio(1、2、4、8μmol·L^(-1))处理H1299细胞24、48 h,CCK8法检测细胞的增殖能力。选择低于IC_(50)浓度的Dio(1、2μmol·L^(-1))作用于H1299细胞,采用细胞划痕实验和Transwell穿膜实验观察不同浓度Dio对H1299细胞迁移能力的影响;采用铺有Matrigel胶的Transwell实验检测Dio对H1299细胞侵袭能力的影响;Western Blot法检测Dio对H1299细胞中E-cadherin、Zonula occluden 1(ZO-1)、ZEB1、Cludin-1、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、PI3K、AKT、P-AKT蛋白表达的影响;免疫荧光法检测间质标志物Vimentin在细胞中的定位及表达情况。结果 Dio干预24、48 h后的IC_(50)值分别为3.50、3.21μmol·L^(-1),且呈现浓度依赖性。Dio干预后与空白对照组比较,Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组的细胞愈合率显著降低(P<0.05,P<0.001);Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组均能显著抑制H1299细胞的迁移能力(P <0.001),并显著抑制H1299细胞体外侵袭能力(P <0.001);Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组能明显上调E-cadherin、ZO-1和Cludin-1蛋白的表达(P <0.05,P <0.01,P <0.001),下调N-cadherin、Vimentin、ZEB1、β-catenin蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、AKT、P-AKT的表达(P <0.05,P <0.01,P <0.001);Dio 1、2μmol·L^(-1)浓度组免疫荧光定位表达结果显示Vimentin表达明显降低。结论 Dio能有效抑制人肺腺癌H1299细胞增殖,低于IC_(50)浓度的Dio(1、2μmol·L^(-1))能明显抑制H1299细胞的迁移与侵袭能力,可能与通过调控PI3K/AKT信号通路有关。

黏蛋白13在肺腺癌组织中的表达及其对A549细胞恶性生物学行为的影响与可能的机制

目的:探讨黏蛋白13(MUC13)在肺腺癌组织中的表达及其对A549细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及EMT的影响与可能的机制。方法:通过癌症基因组图谱(TCGA)和高通量基因表达(GEO)数据库分析MUC13在肺腺癌组织与正常肺组织、癌旁组织中的差异表达。qPCR法和WB法检测人肺腺癌细胞NCI-H1395、NCI-H1975、H1299、A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B中MUC13 mRNA和蛋白的表达水平。利用si RNA技术敲低A549细胞中MUC13表达,实验分为si-MUC13组、NC组和si-MUC13+IGF-1组。通过克隆形成实验、流式细胞术和Transwell实验分别检测敲低MUC13对A549细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响,WB法检测敲低MUC13对A549细胞上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白表达的影响。结果:MUC13 mRNA和蛋白在肺腺癌组织和细胞中均呈高表达(均P<0.01),选取表达水平较高的A549细胞进行后续实验。敲低MUC13后,A549细胞的增殖能力显著降低,G0/G1期的细胞数量显著增多、G2/M期及S期的细胞数量显著减少,细胞凋亡率显著升高,细胞迁移及侵袭能力均显著降低(均P<0.01);A549细胞中E-cadherin表达显著上调,N-cadherin、vimentin表达显著下调,p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值均显著降低(均P<0.01);再加入IGF-1处理后,A549细胞中p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值均显著升高(均P<0.01)。结论:MUC13在肺腺癌组织和细胞中均呈高表达,其可能通过激活EGFR/PI3K/AKT信号通路促进A549细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。

LncRNA PKD2-2-3对肺腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力的影响

背景与目的:长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在肺腺癌患者中异常表达,与肿瘤的发生、发展和化疗耐药密切相关。本研究旨在探讨lncRNA蛋白激酶D2(lncRNA PKD2-2-3)在肺腺癌发生、发展过程中发挥的生物学功能,验证lncRNA PKD2-2-3对肺腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。方法:基于Affymetrix人类基因芯片转录组阵列2(Affymetrix?GeneChip Human Transcriptome Array 2.0,HTA2.0)分析3对肺腺癌组织及癌旁组织,寻找在肺腺癌组织中高表达的lncRNA,其中lncRNA PKD2-2-3的表达差异最大。利用基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中GSE19188和GSE30219的数据分析lncRNA PKD2-2-3在肺腺癌组织中的表达和对患者预后的影响。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测lncRNA PKD2-2-3在细胞系(HBE、A549、PC9)中的表达情况。在A549和PC9两种细胞系中使用siRNA干扰技术敲低lncRNA PKD2-2-3的表达,通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)实验和克隆形成实验检测lncRNA PKD2-2-3表达对肺腺癌细胞增殖和克隆形成能力的影响;划痕实验和transwell实验分别检测lncRNA PKD2-2-3表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响。蛋白质印迹法(Western blot)检测敲低lncRNA PKD2-2-3表达后对上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达水平的影响。皮下移植瘤模型探究lncRNA PKD2-2-3在体内对肺腺癌细胞增殖的影响。结果:LncRNA PKD2-2-3在肺腺癌组织中呈高表达,且高表达的患者预后较差。对比正常气管上皮永生化细胞HBE,lncRNA PKD2-2-3在肺腺癌细胞系A549和PC9中高表达,敲低lncRNA PKD2-2-3的表达抑制肺腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。Western blot结果显示,敲低lnc RNA PKD2-2-3后,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin表达水平降低。皮下移植瘤实验表明,在体内lncRNA PKD2-2-3敲低后抑制肺腺癌的生长。结论:lncRNA PKD2-2-3在肺腺癌组织中上调表达,且与患者的不良预后相关,lncRNA PKD2-2-3的高表达促进肺腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,体内外实验表明lncRNA PKD2-2-3的表达与肺腺癌的EMT过程密切相关。

UHRF1基因沉默对人肺腺癌A549细胞侵袭和迁移的影响及机制

目的观察泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)基因沉默对肺腺癌A549细胞侵袭和迁移能力的影响,并探讨其机制。方法将细胞随机分为3组,沉默组、空载组分别转染针对UHRF1基因的靶向shRNA干扰慢病毒质粒及阴性对照慢病毒空载质粒72 h,对照组不转染。采用Transwell实验观察细胞体外侵袭能力(穿膜细胞数),细胞划痕实验观察细胞体外迁移能力(24 h划痕相对宽度);分别采用RT-PCR法和Western blotting法检测细胞中的UHRF1、上皮间质转化(EMT)相关分子(E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin)mRNA和蛋白;甲基化特异性PCR检测细胞中KISS1和PAX5基因启动子区甲基化程度。结果与对照组和空载组比较,沉默组穿膜细胞减少,24 h划痕相对宽度增大,细胞中UHRF1、N-Cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达减少,E-Cadherin mRNA和蛋白表达增加,KISS1、PAX5启动子区甲基化程度低(P均<0.01);对照组和空载组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。结论慢病毒介导的shRNA沉默UHRF1基因表达,可抑制A549细胞侵袭和迁移能力;其机制可能与降低KISS1和PAX5基因启动子区的甲基化程度,从而抑制EMT过程有关。

藤黄酸对人肺腺癌A549细胞上皮-间质转化的影响及机制研究

目的观察藤黄酸(gambogic acid,GA)作用于转化生长因子诱导的人肺腺癌A549细胞后上皮-间质转化过程的变化,研究药物作用对细胞增殖、迁移、侵袭等的影响,探讨藤黄酸抑制非小细胞肺癌转移的可能机制。方法利用细胞增殖、细胞划痕和Transwell小室实验分别检测藤黄酸对各组人肺腺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力的改变;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组内细胞上皮-间质转化(EMT)关键蛋白和mRNA的表达情况。结果藤黄酸能明显抑制细胞增殖,高浓度组作用显著;细胞划痕0、24、48 h的结果与加药浓度呈正相关;Transwell小室实验表明,藤黄酸干预后高浓度组对细胞侵袭能力有明显抑制作用;Real-time PCR和Western blot显示,与空白组相比,藤黄酸干预后对上皮细胞特性蛋白的基因转录以及蛋白表达有促进作用,而对黏附连接的蛋白基因转录及蛋白表达均有显著的抑制作用(P<0.05)。结论藤黄酸能显著抑制人肺腺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭;对转化生长因子-β(TGF-β)诱导后的EMT信号通路中的相关蛋白表达有明显影响作用。

原发性侵袭性肺曲霉病1例

1 病例介绍患者,男,30岁,因“咳嗽、咯痰、发热20余d,声嘶10d”于2014年12月24日入院。20多d前患者受凉后出现咳嗽,咯少量白色泡沫痰,伴畏寒、发热、活动后稍气促,最高体温39℃,以午后发热为主,无咯血、胸痛、潮热、盗汗、恶心、呕吐。自行服药(具体不详)后病情无好转,仍咳嗽、咳痰、发热。10d前无明显诱因出现声嘶,至当地医院就诊,胸部CT提示“双肺见多发斑点、斑片状致密影,部分病灶内见含气支气管征”,支气管镜检查示“声门、气管上段、右上叶尖段、右下叶开口、左上叶尖段管壁附着白色坏死样物”,支气管镜刷片及灌洗液见“大量中性白细胞、脓细胞及少量上皮细胞”。

贞芪颗粒抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌黏附及侵袭人肺上皮细胞的作用机制研究

目的探究贞芪颗粒(ZQ)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)黏附及侵袭人肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)的抑制作用与机制。方法常规培养BEAS-2B细胞,使用不同浓度(7.5、10、12.5 mg/mL)ZQ处理细胞,同时设置对照组(Control组,只含DMEM培养液的细胞),细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测算细胞活力,以对细胞活力无显著影响的浓度作为ZQ的实验浓度。取部分细胞随机分为Control组、ZQ组,ZQ组给予实验浓度ZQ进行预处理后建立MRSA感染BEAS-2B细胞模型,平板菌落计数法观察MRSA黏附及侵袭细胞的能力;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ZQ对MRSA黏附基因(fnbA、clfA、clfB、icaA、cna、efb、sasX)以及BEAS-2B细胞紧密连接(TJ)蛋白编码基因(claudin-1、ZO-1、occludin)的影响;Western blotting法检测ZQ对BEAS-2B细胞TJ蛋白表达的影响。结果与Control组比较,7.5、10 mg/mL浓度的ZQ组细胞活力高(P<0.01),12.5 mg/mL组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。因此选取12.5 mg/mL为ZQ的实验浓度。与Control组比较,ZQ组MRSA菌落数少(P<0.05),相对黏附率、相对侵袭率低(P<0.05),fnbA、clfA、clfB、icaA、cna基因表达低(P<0.05),efb、sasX表达差异无统计学意义(P>0.05),claudin-1、ZO-1、occludin基因与TJ蛋白表达均高(P<0.01)。结论ZQ可以抑制MRSA对BEAS-2B细胞的黏附及侵袭,该作用与降低MRSA黏附基因和提升TJ蛋白表达有关。

康莱特注射液调控胆固醇代谢以抑制肺腺癌A549细胞的恶性生物学行为

目的:明确康莱特注射液(KLTi)通过调控胆固醇代谢对肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的抑制作用。方法:构建A549细胞体外培养模型,设置空白对照组(CON组)、KLTi组、顺铂(DDP)组及KLTi+DDP组,分别给予对应药物干预,采用CCK-8法检测不同分组的药物干预对A549细胞增殖的影响,并确定IC50值用于后续实验;使用细胞划痕实验、平板克隆形成实验、Transwell侵袭实验观察不同分组药物对A549细胞恶性生物学行为的影响;流式细胞术检测不同分组药物对A549细胞晚期凋亡水平的影响;WB法检测各组细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达,ELISA法检测促炎因子释放水平。采用比色法检测细胞胆固醇含量水平的组间差异,借助WB法检测胆固醇代谢相关膜通道蛋白ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)及功能蛋白ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、肽基脯氨酰异构酶B(PPIB)表达水平差异。结果:KLTi及DDP对A549细胞抑制作用具有时间及剂量依赖性(均P<0.05),最终选择2 mg/mL KLTi、3μg/mL DDP作为干预剂量,按分组加药干预48 h后显示,KLTi单用或联合DDP均可抑制A549细胞克隆形成、迁移、侵袭能力且促进其晚期凋亡,KLTi+DDP组的效果更加明显(P<0.05或P<0.01);KLTi单用或联合DDP可通过调控E-cadherin、vimentin、snail蛋白表达从而影响A549细胞EMT进程(P<0.05或P<0.01),同时下调IL-6及IL-8的释放水平(P<0.05或P<0.01)。KLTi单用及联合DDP均可以明显降低A549细胞胆固醇含量(P<0.05或P<0.01),并且对ABCA1、ACLY、PPIB表达具有调控作用,联合组的效果更加明显(P<0.05或P<0.01)。结论:KLTi可能通过调控胆固醇代谢水平及相关通道蛋白抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为及EMT进程。

LAMC3在肺腺癌中的表达及对细胞生物学行为的影响

目的:探讨层粘连蛋白亚基γ3(laminin subunit gamma 3,LAMC3)在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)中的表达及对细胞生物学行为的影响。方法:通过在线生物信息学数据库GEPIA查询LAMC3在LUAD组织中的表达情况;收集2018年1月至2020年12月本院收治的行LUAD手术的48例LUAD患者的LUAD组织及癌旁组织,使用RT-qPCR检测了组织中LAMC3的mRNA表达水平,并分析LAMC3表达水平与LUAD患者临床病理特征的相关性。体外培养人LUAD细胞株(A549、H1299、PC-9)和人正常肺细胞株MRC-5,使用RT-qPCR和Western blot检测了细胞中LAMC3的mRNA和蛋白表达水平。将PC-9细胞分为5组:对照组(control组)、si-NC组、LAMC3沉默组、pcDNA3.1-NC组、LAMC3过表达组,采用小分子RNA干扰技术(siRNA)和pcDNA3.1质粒转染构建LAMC3沉默/过表达细胞,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中LAMC3的mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测各组细胞增殖活力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Transwell小室实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力;Western blot检测各组细胞中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin,VIM)、基质金属蛋白9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)]的表达。结果:LAMC3在LUAD组织和细胞中低表达,且LAMC3低表达与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。沉默LAMC3后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及N-cadherin、VIM、MMP-9的表达升高,细胞凋亡率和E-cadherin的表达降低(P<0.05);过表达LAMC3后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低,细胞凋亡率升高(P<0.05),且LAMC3过表达后细胞中E-cadherin的表达升高,N-cadherin、VIM、MMP-9的表达降低(P<0.05)。结论:LAMC3在LUAD的发生发展中发挥着重要作用,过表达LAMC3可抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与抑制EMT有关。