RNAi表达载体干扰四型肽精氨酸脱亚氨基酶基因在HL-60细胞系中的表达

目的:设计针对PADI-4基因的RNAi表达载体,抑制PADI-4基因在HL-60细胞中的表达,初步确定PADI-4基因在类风湿性关节炎发生发展中的作用,为后续研究奠定实验基础。方法:设计并合成4对针对PADI-4基因编码区的核苷酸链,核苷酸链经体外退火后形成双链SiRNA,克隆进入pSiRNA-hH1neo G2空载体后转化入GT116细胞,通过蓝白斑筛选后,挑取白斑进行扩增,抽提质粒并对重组质粒进行双酶切分析。以脂质体转染法,分别将pSiRNA-hH1neo G2空载体和4个重组质粒载体转染进入HL-60细胞系,于转染的第3、5、7、10、14天后收集细胞,抽提细胞总RNA后,反转录成cDNA,用Real-time PCR技术检测各实验组HL-60细胞内PADI-4基因mRNA水平的表达情况,并做统计分析。结果:经Acc65Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定,重组质粒中已经插入目的片段,为合格质粒;转染pSiRNA表达载体后,HL-60细胞系中PADI-4基因mRNA表达水平下降,其中以第3号载体的干扰效果最优,干扰效率达到62%。结论:成功构建针对PADI-4基因的pSiRNA表达载体,并且筛选出干扰效率最好的载体,为后续研究PADI-4基因在类风湿性关节炎中的作用奠定实验基础。

肽酰基精氨酸脱亚胺酶检测对类风湿关节炎诊断价值

目的：研究肽酰基精氨酸脱亚胺酶（PADI-4）在类风湿关节炎（RA）中的诊断意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法检测58例 RA 患者，40例其他风湿性疾病和30名健康志愿者血清中的 PADI-4、抗核周因子（APF）、抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体和抗角蛋白抗体（AKA）的含量，应用 ROC曲线、方差分析和相关性分析对各项指标进行评价。结果 RA患者血清中PADI-4浓度（2.653±2.719 U／L）显著高于其他风湿性疾病组（0.872±0.292 U／L）和健康组（0.793±0.243 U／L），差异有统计学意义（t＝22.732，35.371，P 均＜0.01）；采用受试者工作曲线（ROC），PADI-4诊断 RA的最佳临界值为1.284 U／L，此时的灵敏度为62.1％，特异度为91.4％；PADI-4阳性率（62.1％）与 APF（50％）， AKA （56.9％）之间差异无统计学意义（χ2＝0.322，P＝0.570；χ2＝1.715，P＝0.190），与抗CCP抗体（81.1％）之间差异有统计学意义（χ2＝4.161，P＝0.041）；PADI-4水平与 APF，AKA 之间呈正相关（r＝0.652，0.01，0.666，P＜0.01），与抗CCP抗体之间未显示出相关性（r＝0.122，P＝0.357）。结论 PADI-4在部分 RA患者血清中显著升高，PADI-4对 RA具有良好的灵敏度和特异度，可能成为独立于抗CCP抗体之外的 RA的一种新的诊断标志物。