跨膜接头蛋白PAG1过表达对皮肤鳞癌细胞A431运动能力的影响

目的研究跨膜接头蛋白PAG1过表达对人皮肤鳞状细胞癌A431运动能力的影响。方法构建PAG1-EGFP融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立PAG1过表达的A431细胞株,实验分为3组:亲本细胞组(未进行基因转染的A431细胞)、对照组(A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒)、实验组(A431细胞转染PAG1-EGFP病毒)。流式细胞术检测细胞转染率,实时荧光定量PCR及Western blot检测转染后PAG1 mRNA及其蛋白表达,进一步验证细胞转染成功与否;利用划痕修复实验、Transwell迁移实验、侵袭实验三种不同的方法检测PAG1基因的过表达是否会对皮肤鳞癌细胞的生长、迁移和侵袭能力产生影响。结果实验组和对照组目的基因病毒的转染表达率分别为(94.97±0.15)%、(94.60±0.35)%;实验组细胞中PAG1基因m RNA的表达量约为亲本细胞组的1.6倍(P=0.000),转染后实验组中PAG1蛋白的相对表达水平明显增加(P=0.000),建立了稳定过表达PAG1的A431细胞系;PAG1过表达明显降低A431细胞愈合率(P=0.000);实验组A431细胞迁移、侵袭能力明显降低(P=0.001,P=0.000)。结论 PAG1的过表达能抑制人皮肤鳞癌细胞运动能力,影响肿瘤的浸润及远处转移。

白花蛇舌草多糖下调miR-21-5p/PAG1对皮肤鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨白花蛇舌草多糖(HDP)对皮肤鳞癌细胞A431增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪法分别检测不同浓度HDP对A431细胞增殖和凋亡的影响,Transwell法检测HDP对A431细胞迁移和侵袭的影响,qRT-PCR检测HDP对A431细胞中miR-21-5p表达的影响,构建抑制表达miR-21-5p的A431细胞并分析抑制miR-21-5p表达后细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力变化,构建过表达miR-21-5p和抑制表达PAG1的A431细胞并分析HDP对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果与Con组比较,HDP 200μg/ml组A431细胞中miR-21-5p相对表达量显著降低(P<0.05),细胞中E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05),MMP-2蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞迁移数目和侵袭数目显著减少(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较,anti-miR-21-5p组A431细胞中miR-21-5p相对表达量显著降低(P<0.05),CyclinD1、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05),p21、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著升高(P<0.05),细胞中E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05),MMP-2蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞迁移数目和侵袭数目显著减少(P<0.05)。与HDP+miR-NC组比较,HDP+miR-21-5p组A431细胞中miR-21-5p相对表达量显著升高(P<0.05),Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),p21、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05),细胞中E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05),MMP-2蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞迁移数目和侵袭数目显著增多(P<0.05)。结论HDP有抑制皮肤鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进其凋亡的作用,其作用机制可能与调控miR-21-5p/PAG1表达有关。

MiRNA-218对PAG1的调控及其对卵巢癌干细胞的影响

目的:研究miR-218在卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs)中的表达,并探讨其对PAG1的调控作用和对OCSCs的影响及作用机制。方法:收集卵巢癌患者新鲜肿瘤组织,分离培养原代卵巢癌细胞,用流式细胞仪筛选出CD133^+表型的OCSCs。采用Western印迹法检测干性特异相关基因Nanog和Sox2蛋白的表达。qRT-PCR检测miR-218在OCSCs中的表达。miR-218 mimic转染OCSCs,分为miR-218mimic组和miR-218NC组,MTS检测各组OCSCs增殖;软琼脂克隆实验检测各组OCSCs肿瘤球形成能力的影响;miR-218过表达慢病毒质粒及对照质粒vector感染OCSCs,经1.0μg/mL嘌呤霉素筛选稳定过表达miR-218或vector的OCSCs细胞,注射到BALB/c裸鼠中,观察miR-218对OCSCs体内成瘤能力的影响。Targetscan7.2预测软件及双荧光素酶报道基因试验,分析miR-218对PAG1基因的靶向作用,qRT-PCR检测miR-218mimic组和miR-218NC组OCSCs中PAG1mRNA的表达。Western印迹法检测miR-218mimic组和miR-218NC组OCSCs中pSrc和pAKT蛋白的表达。结果:Nanog和Sox2蛋白在CD133^+表型OCSCs中的表达显著高于CD133-表型OCSCs中的表达;miR-218在CD133^+表型OCSCs中的表达显著低于CD133-表型OCSCs中的表达(P<0.05)。miR-218mimic组OCSCs增殖减慢,OCSCs肿瘤球形成能力下降。OCSCs_(miR-218)裸鼠成瘤体积显著低于OCSCsvector组(P<0.05)。TargetScan7.2软件预测和双荧光素酶报道基因试验证实PAG1为miR-218的靶基因,miR-218 mimic组PAG1 mRNA的表达减少。Western印迹法检测miR-218 mimic组OCSCs中pSrc和pAKT蛋白的表达显著减少。结论:MiR-218在OCSCs中低表达,可能通过靶向下调PAG1,抑制pSrc和pAKT蛋白的表达影响OCSCs的干性。

PAG1相互作用蛋白的筛选和验证

目的:在原发性放射抗拒喉癌细胞中筛选鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(PAG1)的相互作用蛋白并验证其相互作用情况。方法:采用免疫沉淀技术通过特异抗体富集PAG1结合蛋白,SDS-PAGE对免疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取PAG1结合蛋白条带,质谱鉴定其成分,NCBI数据库检索各个蛋白功能,进一步运用免疫荧光双标法验证互作蛋白。结果:利用免疫沉淀联合质谱分析筛选得到包括整合素β1在内的9个候选蛋白质,免疫荧光双标法证实PAG1与整合素β1能共定位。结论:原发性放射抗拒喉癌细胞中PAG1与整合素β1存在相互作用,为进一步研究PAG1功能奠定基础。

PAG1与整合素β1的相互作用及其位点分析

目的:在原发性放射抵抗喉癌细胞中分析鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(PAG1)与整合素β1的相互作用情况,并探讨PAG1与整合素β1的结合基序。方法:提取Hep-2max细胞总蛋白,采用免疫共沉淀技术检测PAG1、整合素β1相互作用;进一步运用多肽阵列技术在聚乙二醇(PEG)修饰纤维素膜上合成覆盖PAG1蛋白全部序列的多肽阵列,包含7个重复氨基酸,多肽长度为12个氨基酸,将阵列与整合素β1重组蛋白孵育,通过整合素β1特异抗体检测,使用TotalLab软件分析各点光密度。结果:PAG1免疫沉淀复合物中检测到整合素β1,整合素β1免疫沉淀复合物中检测到PAG1;PAG1多肽阵列两个区域存在阳性结合反应,分别位于Pro^(216)-Arg^(232)和Asn^(356)-Gly^(377)之间。结论:PAG1与整合素β1的相互结合在喉癌原发性放射抵抗中发挥重要作用。

抑制PAG1表达逆转喉癌细胞原发性放射抗拒机制探讨

目的鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains 1,PAG1)是定位于细胞膜脂筏的跨膜接头蛋白,与肿瘤的发生发展有着密切关系。本研究探讨抑制PAG1表达对喉癌细胞原发性放射抗拒的影响。方法针对人PAG1mRNA序列,设计3条特异性shRNA序列,与酶切后的GV248质粒连接形成表达载体。测序鉴定正确后,经脂质体介导分别转染原发性放射抗拒喉癌细胞Hep-2max,荧光定量PCR及蛋白质印迹法验证干扰效果,筛选出最佳靶向序列。进而使用含最佳靶向序列的载体转染Hep-2max细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。8Gy放射线处理后,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡情况。结果荧光定量PCR及蛋白质印迹结果显示,PAG1-shRNA1干扰位点的质粒干扰效果最佳,并获得稳定转染细胞模型。流式细胞术检测结果显示,空白对照组、阴性质粒对照组和PAG1干扰组G2/M期细胞所占比例分别为(39.17±1.62)%、(35.58±1.94)%和(45.28±1.68)%,F=9.837,P=0.013 1;细胞凋亡率分别为(28.46±2.43)%、(29.25±2.89)%和(43.68±1.78)%,F=12.67,P=0.011 1。结论抑制PAG1的表达可促进原发性放射抗拒喉癌细胞Hep-2max凋亡,增加G2/M期细胞比例,从而逆转细胞原发性放射抗拒,并为喉癌放射增敏研究提供新的靶点。

辣椒PPI蛋白与AGAMOUS-like蛋白间相互作用的鉴定

利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补(Bi FC)技术,对控制花器官发育的B类蛋白,即PPI(Gen Bank登录号:GU812176)与两个AGAMOUS-like蛋白即已被分别命名的PAG1(Capana02g001695)和PAG2(Capana07g001940)间的互作关系进行了研究。结果表明,PPI蛋白与PAG1和PAG2蛋白均存在特异性相互作用,说明辣椒花器官发育过程中PPI蛋白可能与PAG1和PAG2形成蛋白复合体,共同控制雄蕊的发育。这有助于进一步揭示辣椒雄蕊发育的分子机理。