Pax6 PAI亚结构域在黑色素细胞中对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的影响

【目的】高度保守的PAX转录因子家族在黑色素细胞的分化和黑色素的生成中起重要的作用,其家族共有的PD结构域是其与下游基因结合的主要位点,而PD结构域氨基端的PAI亚结构域在其与下游基因的结合过程中发挥重要的作用。研究表明Pax6在视网膜上皮黑色素细胞的分化中发挥至关重要的作用,本试验借助研究Pax6 PAI亚结构域的功能来对PAX转录因子家族共有的PD结构域和PAI亚结构域进行研究。【方法】首先通过Psipred对Pax6 PD结构域的结构进行分析,使用NCBI对Pax6 PD结构域与下游基因的结合位点进行分析,使用Jaspar对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2启动子中Pax6 PD结构域可能的作用位点进行预测。使用普通PCR克隆Pax6PAI亚结构域,将其连入T载体,酶切后连入慢病毒载体,并送公司测序确认。将构建好的PAI亚结构域过表达载体通过细胞转染导入到培养的小鼠黑色素细胞中,使其过量表达。收集细胞,分别通过观察绿色荧光蛋白检测转染效率,使用RT-PCR和Western blot来检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2在m RNA和蛋白水平的变化,同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】通过NCBI分析可知,Pax6 PD结构域与下游基因的作用位点主要集中在氨基端的PAI亚结构域。通过Jaspar预测分析,得知,MITF启动子-695处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYR启动子-873和-1133处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYRP1启动子-629处存在Pax6 PD结构域的结合位点,TYRP2启动子-655处存在Pax6 PD结构域的结合位点。在黑色素细胞中过表达Pax6 PAI亚结构域后,与空载组相比,试验组MITF m RNA升高2.05倍(P<0.01),蛋白质升高1.7倍(P<0.01);TYR m RNA升高2.09倍,蛋白质升高2倍(P<0.05);TYRP1 m RNA升高2.93倍(P<0.05),蛋白质升高1.9倍(P<0.01);TYRP2 m RNA升高3.62倍(P<0.01),蛋白质升高1.37倍。同时试验组的黑色素含量是空载组黑色素含量的1.33倍(P<0.001)。【结论】在小鼠黑色素细胞中,过表达Pax6 PAI亚结构域可以促进MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,进而使黑色素细胞黑色素的生成量增加。