miR-139-5p靶向PAK5基因通过Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞侵袭和迁移的影响

背景胃癌(Gastric cancer,GC)是人类消化系统最常见的癌症类型,发生局部或全身转移是导致患者预后差的主要原因.微小RNA(microRNA,miRNA)是胃癌发生发展的重要调控因子.然而,miR-139-5p对胃癌细胞侵袭和转移的影响及机制尚不清楚.目的探究miR-139-5p靶向p21活化的激酶5(PAK5)基因调控Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞侵袭和迁移的影响.方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别检测永生化胃黏膜细胞GES1和不同胃癌细胞SGC-7901、AGS和BGC-823中miR-139-5p和PAK5的表达情况;在胃癌SGC-7901细胞中转染miR-139-5p mimics,qRT-PCR检测转染效果;Transwell侵袭和划痕实验检测过表达miR-139-5p对SGC-7901细胞侵袭和迁移能力的影响;双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测miR-139-5p对PAK5的靶向调控关系;Western blot检测过表达miR-139-5p对Wnt/β-catenin信号通路激活的影响.结果胃癌细胞中miR-139-5p的表达水平明显低于正常胃黏膜细胞(P<0.05),而PAK5 mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常胃黏膜细胞(P<0.05);转染miR-139-5p mimics能够上调SGC-7901细胞中miR-139-5p的表达;过表达miR-139-5p可明显抑制SGC-7901细胞侵袭和迁移能力;双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测结果显示,miR-139-5p可靶向负调控PAK5的表达;过表达miR-139-5p后,SGC-7901细胞中Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白表达均明显下调.结论miR-139-5p靶向PAK5并通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞侵袭和迁移能力.

LncRNA SNHG15/miR-123/PAK5轴通过自噬对胃癌细胞活性及血管生成的影响

目的探讨lncRNA SNHG15/miR-123/PAK5轴通过调节自噬对胃癌细胞活性及血管生成的机制研究。方法将胃癌SCG-823细胞分为Control组、si-NC组、si-SNHG15组、miR-NC组、miR-123组、pcDNAPAK5组。RT-PCR检测细胞中SNHG15和miR-123表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡能力;Matrigel体外成管实验检测细胞血管生成能力;蛋白质印迹检测细胞中PAK5、VEGF、LC3、Beclin1、p62蛋白表达;双荧光素酶报告基因检验SNHG15和miR-123、miR-123和PAK5的靶向关系。结果与人胃黏膜细胞系GES-1相比,人胃癌细胞系中ASG、MKN-45、SCG-823细胞中SNHG15表达明显升高,miR-123表达明显降低(P<0.05);且SCG-823细胞中SNHG15表达明显高于ASG、MKN-45细胞,miR-123表达明显低于ASG、MKN-45细胞(P<0.05)。si-SNHG15组细胞增殖、侵袭及形成小管数量均明显低于Control组,细胞凋亡率高于Control组(P<0.05);si-SNHG15组细胞中VEGF、PAK5、p62蛋白表达明显低于Control组,LC3Ⅱ/LC3Ι比值及Beclin1蛋白表达明显高于Control组(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-123组细胞增殖、侵袭及形成小管数量均明显降低,细胞凋亡率明显增加(P<0.05);miR-123组细胞中VEGF、PAK5、p62蛋白表达明显低于miR-NC组组,LC3Ⅱ/LC3Ι比值及Beclin1蛋白表达明显高于miRNC组(P<0.05)。通过向细胞中分别转染野生型SNHG15(SNHG15-WT)、PAK5(SNHG15-WT)时,miR-123组荧光素酶活性均明显低于miR-NC组(P<0.05)。与si-SNHG15组相比,pcDNA-PAK5组细胞细胞增殖、侵袭及形成小管数量均明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05);pcDNA-PAK5组细胞中VEGF、PAK5、p62蛋白表达明显高于si-SNHG15组,LC3Ⅱ/LC3Ι比值及Beclin1蛋白表达明显低于si-SNHG15组(P<0.05)。结论lncRNA SNHG15可靶向miR-123/PAK5轴抑制胃癌细胞增殖、侵袭和血管生成,促进胃癌细胞凋亡和自噬,进而为调控自噬途径治疗胃癌提供新的思路。

抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用

目的克隆PAK5-N端基因并诱导其表达,进行多克隆抗体制备,为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础。方法根据人全长PAK5cDNA序列,设计引物;利用PCR技术,以PAK5全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因,将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中,经EcoRI/XhoI双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达。利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化,通过免疫家兔制备多克隆抗体,并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论成功克隆了PAK5-N端基因,在E.coli中表达了PAK5-NT,并纯化了GST融合蛋白,制备了PAK5特异性抗体。Westernblotting表明PAK5在牙胚细胞中过度表达,为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。

微RNA-129-5p下调PAK5表达并调控骨肉瘤细胞增殖和凋亡

目的 :探讨微RNA-129-5p(microRNA-129-5p,miR-129-5p)对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响,以及其可能的分子作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测骨肉瘤细胞MG63和成骨细胞hFOB1.19中miR-129-5p表达的差异。将miR-129-5p模拟物转染至骨肉瘤MG63细胞,并采用实时荧光定量PCR法验证转染效率后,CCK-8和平板克隆形成实验检测骨肉瘤细胞增殖;FCM法检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-129-5p和靶基因p21活化激酶5(p21-activated kinase 5,PAK 5)的相互作用;实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测PAK5 mRNA和蛋白水平的变化;蛋白质印迹法检测磷酸化糖原合成酶激酶3β(phospho-glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)和β-连环蛋白(β-catenin)表达水平的变化。将siRNA-PAK5、PAK5重组质粒以及miR-129-5p mimics+PAK5重组质粒分别转染骨肉瘤MG63细胞后,采用上述方法进一步验证miR-129-5p对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的分子作用机制。结果 :miR-129-5p在骨肉瘤MG63细胞中低表达(P <0.05)。转染miR-129-5p模拟物后,骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成能力降低(P <0.001,P <0.01),而细胞凋亡率升高(P <0.05)。mi R-129-5p负性调控PAK5基因表达(P <0.05)。转染miR-129-5p模拟物或siRNA-PAK5后,PAK5mRNA和蛋白表达水平明显降低(P值均<0.01),而且p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达水平也明显降低(P <0.05,P <0.01);而过表达PAK5可以恢复miR-129-5p对骨肉瘤细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响(P值均<0.05)。结论 :miR-129-5p通过下调PAK5基因表达,抑制骨肉瘤细胞增殖,促进细胞凋亡;其作用机制可能与调控p-GSK-3β和β-catenin蛋白表达相关。