bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性与安全性

在转基因技术得到认同并且给全球带来了巨大的经济和社会价值的同时,也引起了人们对其安全性的关注。目前在转基因作物中抗除草剂作物种植面积最大。本文对除草剂草丁膦及其抗性基因之一——bar基因及其产物PAT蛋白的一些特性和安全性作了阐述。bar基因及筛选剂草丁膦在植物基因工程中发挥着重要作用。bar基因无多效性,与食物中的DNA一样安全。PAT蛋白对小鼠无直接毒性,与已知毒素和过敏原无同源性、无糖基化位点,其热稳定性和消化稳定性无食物过敏原和毒素的特性,对人体和动物安全无毒性。草丁膦是一种生物除草剂,在土壤中易被快速分解,作物收获时未检出残留,对哺乳动物无毒性作用。

转基因作物pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究

将克隆到的pat基因构建原核表达载体pET30（＋）-pat并在大肠杆菌中进行表达，分离纯化得到高纯度pat蛋白。用所得到的pat蛋白制备了兔多克隆抗体和鼠单抗2F6。多抗效价〉8000，单抗效价为5×10^4；单抗为IgGl类，轻链为，（型。基于抗pat蛋白单克隆抗体和兔多克隆抗体建立了双抗夹心酶联免疫分析方法（SandwichELISA）。检测范围为1．6～100μg／L，线性回归方程y=0．6914x-2．572，决定系数为0．9951。用所建立的方法测定了5个转基因抗虫棉和2个非转基因棉花品种叶片中pat蛋白的含量，其中转基因抗虫棉中的3个品种检测出pat蛋白，其余均未检出pat蛋白。

PAT家族蛋白与肿瘤关系的研究进展

PAT家族蛋白是介导脂质代谢的一类小分子蛋白,包括PLIN1、ADRP、TIP47、S3-12和PLIN5。PAT家族蛋白位于细胞质脂滴表面,通过与其他分子相互作用调控脂质代谢,参与肿瘤的发生发展。本文将对PAT家族蛋白成员与肿瘤关系的研究进展进行综述。

PAT家族蛋白在细胞内脂滴代谢过程中的作用

哺乳动物细胞内的甘油三酯是以脂滴的形式贮存的,现在有很多证据表明,脂滴参与多种代谢过程,因而被看作胞内有功能的细胞器。脂滴含有甘油三酯构成的脂质核心,脂核表面覆盖有单层磷脂,在单层磷脂内镶嵌着在结构上具有相关性的PAT家族蛋白,包括perilipin、ADRP、TIP47和S3-12。本文就这些蛋白在甘油三酯水解和脂滴合成中的调节作用加以综述。

PAT家族蛋白研究进展

PAT家族蛋白(PAT)是脂质代谢中的一类小蛋白分子,它们定位于细胞质脂滴的表面,介导着脂质代谢。PAT家族蛋白并不直接参与脂质的合成和分解,它们通过与其它分子的相互作用而介导脂质代谢。本文将阐述PAT家族蛋白的发现、命名和成员组成,并重点介绍成员围脂滴蛋白(perilipin)和脂肪分化相关蛋白(adi-pophilin,ADRP)的代谢调控和与其它分子的相互作用。

RNA干扰技术在PAT家族蛋白研究中的应用

PAT家族蛋白包括perilipin、adipophilin、TIP47、S3-12和OXPAT 5种蛋白。研究发现这些蛋白定位于脂滴表面,介导脂质代谢,并与肥胖症、糖尿病等脂代谢疾病相关。RNA干扰是一种基因沉默技术,现已广泛应用到生物医药领域,若能通过此技术制备相关生物制剂调节脂质代谢,将为缓解甚至治疗脂代谢疾病提供新思路。本文旨在对RNA干扰技术在PAT家族蛋白研究中的应用作一综述。

EPSPS蛋白和PAT蛋白的模拟胃液消化稳定性分析

目的研究5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)蛋白和膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricina cetyltransferase,PAT)蛋白在模拟胃液中的消化稳定性。方法参照中华人民共和国国家标准(农业部869号公告-2-2007)模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法中模拟胃液的配方,在体外建立模拟胃液消化体系,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(dodecyl sulfate,sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot),分析EPSPS蛋白和PAT蛋白在模拟胃液中不同消化时间点的降解情况。结果EPSPS蛋白和PAT蛋白均在15 s内消化完全,SDS-PAGE和Western blot蛋白免疫印迹均未检测到蛋白残留,EPSPS蛋白和PAT蛋白在模拟胃液中极易被消化。结论EPSPS蛋白和PAT蛋白经过胃液消化后,不具有免疫原性。

PAT蛋白抑制饥饿诱导的脂滴快速融合

目的:脂滴快速融合是增大脂滴直径的方式之一,但其研究相对少。本研究旨在建立脂滴快速融合的细胞模型,以便对其进行深入的生物学研究。方法:本研究使用大鼠肾成纤维细胞系NRK和小鼠前脂肪细胞系3T3-L1两种细胞系,先用油酸诱导细胞内产生大量脂滴,再使用饥饿缓冲液培养细胞,利用显微镜实时观测技术跟踪脂滴动态变化,建立脂滴快速融合的模型。而后在此模型中,加入自噬抑制剂或者以过表达CCT为阳性对照,过表达PAT蛋白(PLIN1、ADRP和TIP47),来探究它们在调控脂滴快速融合方面的功能。结果:饥饿缓冲液处理约3小时可诱导细胞发生脂滴快速融合,其融合速率很快,从脂滴接触到融合完成可发生在20秒内,显然不同于CIDE蛋白调控的缓慢脂滴融合过程。自噬抑制剂可以抑制自噬,但是并没有显著影响脂滴快速融合,说明饥饿诱导的脂滴快速融合不依赖于自噬。另发现,与过表达GFP相比,过表达定位于脂滴的GFP-CCT、GFP-PLIN1、GFP-ADRP或GFP-TIP47均能显著性抑制快速融合导致的脂滴变大的现象。结论:本研究建立了饥饿缓冲液诱导脂滴发生快速融合的细胞模型,并证明PAT蛋白(PLIN1、ADRP、TIP47)能抑制脂滴快速融合。

脂肪分化相关蛋白的研究进展

细胞内脂滴是一种代谢活跃的细胞器,脂滴表面蛋白在脂滴的代谢调节中起到了重要作用。ADRP是一种重要的脂滴表面蛋白,在机体组织和细胞内广泛表达。脂肪肝、动脉粥样硬化、糖尿病等均伴随脂质的异常蓄积,近年来的研究表明ADRP参与这些疾病的发生发展。本文就ADRP在各组织和器官正常的生理功能以及对疾病状态的调控加以综述。

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbs）为基础，建立检测膦丝菌素乙酰转移酶（the phosphinothricin acetyltransferase,PAT）的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因（blalaphos resistance gene）bar，并与表达载体pET28a构建重组质粒，诱导表达产生外源性PAT蛋白；以纯化后的PAT蛋白为免疫原，制备mAbs，建立双抗体夹心ELISA方法，并与PCR检测方法进行比较，确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其有效检测范围为3.125～50 ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测，根据阴阳性判定值OD450〉0.210，检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份，以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份，2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法，可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。

法国海岸松树皮提取物碧萝芷对长链游离脂肪酸诱导的巨噬细胞perilipin2基因表达的影响

目的研究碧萝芷(PYC)对油酸诱导的巨噬细胞perilipin2表达的影响及其相关分子机制。方法应用Real-time PCR和Western blot测定油酸及PYC对perilipin2mRNA和蛋白水平表达影响。应用荧光素酶活性分析方法检测油酸及PYC对perilipin2启动子活性的影响。结果油酸以剂量和浓度依赖方式上调perilipin2mRNA和蛋白水平表达,并促进perilipin2启动子活性。PYC以剂量依赖方式抑制了油酸诱导的perilipin2表达及启动子活性。结论 PYC抑制了巨噬细胞中油酸诱导的perilipin2的表达。PYC通过抑制perilipin2启动子活性,从而直接抑制perilipin2的表达。

Perilipin对脂肪细胞内三酰甘油的代谢调控作用

三酰甘油贮存在哺乳动物细胞内脂滴中,脂滴表面镶嵌着多种蛋白,对脂滴功能具有重要调节作用,因此脂滴也越来越多地被认为是一种代谢活跃的细胞器。新近的研究表明脂滴表面PAT家族蛋白perilipin对脂肪细胞内三酰甘油的代谢起全局性调控作用,本文就脂肪细胞内perilipin的功能予以综述。

转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉幼虫的安全风险评估

为评价我国自主研发的转基因玉米表达的Cry1Ab、PAT和EPSPS蛋白对日本通草蛉Chrysoperla nipponensis幼虫生长发育的安全风险,通过将外源蛋白混入日本通草蛉人工饲料中的方法,以加入砷酸二氢钾(KH_2AsO_4)的饲料为阳性对照,研究了日本通草蛉幼虫取食后的生长发育状况。结果表明:日本通草蛉取食含Cry1Ab和EPSPS蛋白饲料的幼虫发育历期、茧期、结茧率、羽化率及成虫体重等生物学参数与取食正常饲料处理相比均没有显著差异;而取食含PAT蛋白饲料的幼虫发育历期和结茧率分别为10.7 d和96.6%,与取食正常饲料的对照11.1 d和89.9%差异显著,即饲料中添加PAT蛋白显著提高了幼虫的存活率和发育速率;取食含KH_2AsO_4饲料的日本通草蛉幼虫不能存活到茧期,说明KH_2AsO_4具有显著的杀虫活性。ELISA检测结果表明,取食了分别添加有3种外源蛋白饲料的日本通草蛉幼虫体内可以检测到相应的Cry1Ab、EPSPS和PAT蛋白,含量分别为2 758.8~5 210.7、35 018.0~54 426.6、16.8~149.8 ng/g。表明转基因玉米所表达的Cry1Ab、EPSPS和PAT蛋白对日本通草蛉幼虫没有显著的不利影响。