miR-127调控绵羊骨骼肌细胞增殖分化及其转录因子PAX3筛选

旨在探究miR-127对绵羊骨骼肌成肌细胞增殖与分化的影响,并通过鉴定miR-127上游核心启动子区域筛选调控其表达的转录因子。本研究以体外分离培养的小尾寒羊胎羊骨骼肌原代成肌细胞为试验材料,过表达或干扰miR-127后,采用RT-qPCR、EdU染色、流式细胞仪分析、免疫荧光染色等方法探究miR-127对绵羊成肌细胞增殖、凋亡和分化的影响。基于生物信息学分析和双荧光素酶报告试验预测并鉴定绵羊miR-127核心启动子区域及其转录因子。结果表明,在绵羊成肌细胞中过表达miR-127后,促进了细胞增殖相关基因PCNA、CDK4的表达(P<0.01);抑制了细胞凋亡相关基因Caspase3、BAX的表达(P<0.05);EdU结果显示,绵羊成肌细胞中过表达miR-127后,细胞阳性率显著提升(P<0.05);流式细胞仪分析显示,miR-127过表达可显著增加成肌细胞S期和G2期细胞比例并减少成肌细胞的凋亡。在细胞分化试验中,过表达miR-127显著增加了成肌细胞分化相关基因MYOD1和MYHC mRNA的表达水平(P<0.05),显著增加了MYHC的阳性肌管面积(P<0.05)。抑制miR-127表达则出现与上述相反的结果。为进一步揭示调控miR-127表达的调控因子,双荧光素酶活性检测结果显示,miR-127上游1 500~1 800 bp(miR-127-P6)区段活性最高,推断其为miR-127的核心启动子区。生物信息学预测表明,在miR-127核心启动子区存在一个与转录因子PAX3的结合位点。在绵羊成肌细胞中过表达转录因子PAX3后,miR-127启动子活性和miR-127的表达均极显著增加(P<0.01)。本研究表明,绵羊miR-127显著促进绵羊骨骼肌成肌细胞增殖分化,减少了成肌细胞凋亡,进而参与骨骼肌成肌细胞的发育过程;进一步研究发现,绵羊miR-127上游的1 500~1 800 bp是其核心启动子区,转录因子PAX3正向调节miR-127的转录。本研究为进一步探究绵羊肌肉生长发育性状的分子机制提供了理论参考。

2个Ⅰ型Waardenburg综合征家系的基因诊断及产前诊断

目的 分析2个中国汉族Ⅰ型Waardenburg综合征（WS1）家系致病基因PAX3的突变位点,并在此基础上探讨PAX3基因分析用于产前诊断的可行性.方法 2015年7月和2016年3月分别有2例汉族家族遗传性WS1患者在郑州大学第一附属医院就诊,采集2个家系（WS1-01和WS1-02）成员血样并留取临床资料.应用多聚酶链反应（PCR）结合sanger测序和多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）对2个WS1家系中2例先证PAX3基因进行检测,获得变异序列后,针对所检出变异序列对家系成员和健康对照个体的PAX3基因序列进行变异验证分析;确定致病性突变后,对WS1-01家系中的高危胎儿进行孕中期产前诊断.结果 在WS1-01家系的患者中均检测出了PAX3基因第7外显子杂合缺失,家系中表型正常者和20名健康对照者均未检测到此突变;高危胎儿未检测出与患者相同的致病突变,出生后表型正常.在WS1-02家系的2例患者中均检测到AX3基因第8外显子c.1385_1386delCT微小缺失突变（可导致移码框的改变）,家系中表型正常者和200名健康对照者均未检测到此突变.结论 PAX3基因第7外显子缺失突变和第8外显子c.1385_1386delCT是本研究2个WS1家系的致病原因,测序分析结合MLPA技术可对该2个WS1家系进行有效的基因诊断和产前诊断.